Kí hiệu
chủng Gram Hình dạng tế bào Hình dạng khuẩn lạc
M01 + Tế bào que mảnh,
xếp chuỗi
Tròn, hơi lõm xung quanh tâm, màu trong suốt.
2991 + Tế bào hình que, xếp
chuỗi (que mập) Khuẩn lạc trịn, trắng sữa, khơng trơn, rìa nhăn. 4045 + Tế bào hình que, xếp
chuỗi Khuẩn lạc tròn nhỏ, trơn lồi
LA + Tế bào hình que, xếp
chuỗi Khuẩn lạc trịn màu trong suốt Ca
+ Tế bào hình que, xếp chuỗi
Khuẩn lạc trắng sữa, trịn lồi, bề mặt căng bóng
8905
+ Tế bào hình que ngắn, xếp chuỗi hoạc riêng rẽ
Khuẩn lạc tròn nhỏ, trơn lồi.trong
3492 + Tế bào hình trứng Khuẩn lạc trắng sữa, tròn lồi, bề mặt căng bóng. BH + Tế bào hình cầu Khuẩn lạc trắng sữa, tròn lồi, bề mặt căng bóng. 8 chủng vi khuẩn lactic trên mang đặc điểm của vi khuẩn lactic thuộc hai chi
Lactobacillus và Streptococcus. 6/8 chủng có tế bào hình que, xếp chuỗi là các chủng
M01, 2991, 4045, La và Ca. Đây là đặc điểm của các loài trong chi Lactobacillus . 2 chủng có tế bào hình cầu và hình trứng là 3492 và H, đây là đặc điểm của các loài lactic thuộc chi Streptococcus. Các chủng này được phân tích tiếp dựa vào trình tự
Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của một số chủng đại diện:
Hình 3.6. Ảnh khuẩn lạc và tế bào nhuộm gram của các chủng vi khuẩn lactic Ghi chú: (A), (B), (C) lần lượt là ảnh khuẩn lạc của các chủng M01, 2991 và 3492 Ghi chú: (A), (B), (C) lần lượt là ảnh khuẩn lạc của các chủng M01, 2991 và 3492 (bar1mm), (D), (E), (F) lần lượt là ảnh tế bào cảu các chủng M01, 2991 và 3492 (bar 5µm)
3.2.2 Kết quả phân loại bằng sinh học phân tử
Kết quả khi xác định trình tự ADNr 16S, DNA của các chủng vi khuẩn được tách chiết theo phương pháp của Gabor và cộng sự (2003) với một số bước cải biến để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm. Khuếch đại và xác định trình tự ADNr 16S theo quy trình của Sakiyama và cộng sự (2009). Trình tự DNr 16S được phân tích bởi phần mềm CLUSTAL X (Thompson và cộng sự, 1997). Cho thấy 8 chủng LAB gồm 5 loài trong 2 chi Lactobacillus và Streptococcus. Trong đó, chủng M01 là lồi L. bulgaricus, 3 chủng thuộc loài L. acidophilus là 2991. 4045 và LA; Chủng 8905 thuộc L. sakei, Ca thuộc loài L. casei và 2 chủng 3492 và BH thuộc lồi S. thermophilus đều
Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại của các chủng nghiên cứu và một số lồi có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Lactobacillus dựa vào trình tự ADNr 16S
Weissella viridescens_ AB023236
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei _ACGY01000162
Ca
Lactobacillus casei_ FM177140
100
Lactobacillus paracasei subsp. tolerans_D16550
75 Lactobacillus zeae_ D86516 100 Lactobacillus rhamnosus_ D16552 85 Lactobacillus brantae_ HQ022861 Lactobacillus saniviri_ AB602569
100 100
Lactobacillus sakei_AM113784 8905
Lactobacillus sakei subsp. carnosus_AY204889
64 Lactobacillus curvatus_AM113777 Lactobacillus graminis_AM113778 92 59 94 100
Lactobacillus coryniformis_subsp. torquens_AJ575741 Lactobacillus coryniformis_M58813 Lactobacillus rennini_AJ576007 100 70 100 Lactobacillus kimchii_AF183558 56
Lactobacillus psittaci_ AUEI01000022 Lactobacillus acetotolerans_ AB303841 MY01
M01
L. delbrueckii subsp. bulgaricus_CR954253
58
L. delbrueckii subsp. lactis_AEXU01000148 L. delbrueckii subsp. jakobsenii_ JQ801728 L. delbrueckii subsp. delbrueckii_ AY050172
56 L. delbrueckii subsp. indicus_ AY421720
52
L. delbrueckii subsp. sunkii_ AB641833
50 72 Lactobacillus equicursoris_AB290830 100 Lactobacillus gigeriorum_ FR681899 Lactobacillus pasteurii_CAKD01000001 Lactobacillus kalixensis_AY253657 100 Lactobacillus intestinalis_AJ306299 Lactobacillus amylolyticus_Y17361
Lactobacillus hamsteri_AJ306298 L. kefiranofaciens_subsp. kefirgranum_AM113782 L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens_AM113781 Lactobacillus ultunensis_ ACGU01000081
Lactobacillus amylovorus_AY944408 Lactobacillus kitasatonis_AB107638 2991; 4045; LA Lactobacillus acidophilus_AY773947 MM03 Lactobacillus helveticus_AM113779 Lactobacillus gallinarum_AJ417737 66 100 100 Lactobacillus crispatus_AF257097 53 98 57 52 100 84 100 51 53 55 100 89 69 91 94 100 0.02
Cây phát sinh chủng loại của 6 chủng lựa chọn và 31 loài thuộc chi
Lactobacillus được xây dựng dựa vào trình tự ADNr 16S; Weissella viridescens được
sử dụng làm nhóm ngồi (hình 3.7). Quan sát cây phát sinh cho thấy 6 chủng nghiên cứu chia làm 3 nhóm: 3 chủng 2991, 4045 và LA nằm trên vị trí phân loại với nhóm
Lactobacillus acidophilus; chủng M01 nằm cùng vị trí với các lồi L. delbrueckii;
chủng Ca nằm cùng với các lồi thuộc nhóm L. casei; chủng 8905 nằm cùng với các
lồi thuộc nhóm L. sakei. Kết quả so sánh trình tự cho thấy chủng 2991, 4045 và LA và có quan hệ gần gũi nhất với loài Lactobacillus acidophilus BCRC10695 với độ tương đồng đoạn ADNr 16S là 100%; chủng 8905 có quan hệ gần gũi nhất với lồi L. sakei với độ tương đồng là 99,3%. Chủng M01có độ tương đồng đoạn ADNr 16S là 99,7% với Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. Chủng Ca có quan hệ
gần gũi nhất với loài Lactobacillus casei BL23T với độ tương đồng đoạn ADNr 16S là 99,9%.
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của các chủng nghiên cứu và một số lồi có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Streptococcus dựa vào trình tự ADNr 16S
Cây phát sinh chủng loại của 2 chủng vi khuẩn hình cầu lựa chọn và 14 loài thuộc chi Streptococcus được xây dựng dựa vào trình tự ADNr 16S. Lactococcus lactis
subsp. lactis được sử dụng làm nhóm ngồi (hình 3.2). Quan sát cây phát sinh cho thấy
cả 2 chủng 3492 và H đều có quan hệ gần gũi nhất với loài Streptococcus salivarius
subsp. thermophilus ATCC 19258T với độ tương đồng đoạn ADNr 16S là 100%
3.3 Lựa chọn tổ hợp cho lên men
3.3.1 Lên men đơn chủng
Các chủng vi khuẩn lactic được lên men thử nghiệm đơn chủng, theo dõi các chỉ tiêu thời gian lên men và đánh giá cảm quan (Bảng 3.7)