STT Chủng pH ban đầu 4 5 6 7 8 OD600 pH sau nuôi OD600 pH sau nuôi OD600 pH sau nuôi OD600 pH sau nuôi OD600 pH sau nuôi 1 M01 0,16 4,03 1,83 4,06 2,76 4,39 2,85 4,03 1,47 5,26 2 2991 0,56 4,01 1,52 4,15 2,66 3,95 2,65 4,14 1,45 5,02 3 3492 1,05 3,93 2,31 4,76 2,89 3,93 2,77 4,05 1,75 5,09
3.4.5 Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp
Hình 3.14. Sinh trưởng của các chủng LAB trên các nguồn Cacbon khác nhau
Nguồn C tốt nhất cho M01 và 2991 là saccharose còn lactose là nguồn C cho kết quả sinh khối 3492 tốt nhất. Saccharose được lựa chọn cho môi trường nuôi cấy M01 và 2991, cịn lactose là nguồn cacbon ni cấy 3492.
3.4.6 Lựa chọn hàm lƣợng cacbon thích hợp
Hình 3.15. Sinh trưởng của các chủng LAB khi bổ sung hàm lượng đường khác nhau
Khi thay đổi hàm lượng đường từ 0-70 g l trong môi trường MRS để nuôi 3 chủng nghiên cứu, số lượng tế bào thu được có khác nhau nhiều, tăng khi hàm lượng đường tăng từ 0-20 g/l, có xu thế giảm khi hàm lượng đường lớn hơn 40 g l môi trường. Số lượng tế bào cao nhất cho cả 3 chủng ở nồng độ đường 20g l. Từ đó, tỷ lệ đường lactose đối với chủng 3492; đường saccharose với 2 chủng M01 và 2991 là 20g l môi trường.
3.4.7 Lựa chọn nguồn N thích hợp
Tiến hành thay thế các nguồn N khác nhau trong môi trường với hàm lượng tương đương môi trường MRS. Kết quả sinh khối xác định bằng OD600 cho thấy nguồn N ban đầu trong môi trường MRS là phù hợp nhất với 3 chủng M01, 2991 và 3492.
Hình 3.16. Sinh trưởng của các chủng LAB trên các nguồn N khác nhau
3.4.8 Lựa chọn thời gian ni thích hợp
Ni cấy tĩnh các chủng M01, 2991 và 3492 trên môi trường MRS thay thế nguồn C với các điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 37oC, với nguồn N, C thích hợp trong bình tam giác. Theo dõi khả năng sinh trưởng (OD600), số lượng tế bào, hàm lượng D- glucose của các chủng vi khuẩn sau các thời gian nuôi cấy 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48 và 60 giờ.
Hình 3.18. Sinh trưởng của L. acidophilus 2991 theo thời gian
Hình 3.19. Sinh trưởng của S. thermophilus theo thời gian
Từ các biểu đồ trên ta thấy khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu tốt nhất từ khoảng 24 giờ. Khi nuôi tĩnh các chủng vi khuẩn trong 60 giờ, tế bào
của các chủng M01, 2991 và 3492 sinh trưởng theo hàm số mũ theo thời gian nuôi đến 24 giờ. Khi tế bào chuyển sang pha cân bằng, số lượng giảm dần theo thời gian ở giai đoạn cuối nuôi cấy. Ở thời điểm 24 -32 giờ, sinh khối đạt cao nhất; sau đó giảm dần theo thời gian lên men. Sự phát triển mạnh mẽ theo hàm mũ này không thuộc pha lag là nhờ chất lượng giống tốt, giàu dinh dưỡng trong môi trường nuôi và các điều kiện ni cấy tối ưu. Kết quả này cũng góp phần củng cố kết luận của nhiều tác giả về việc nuôi cấy tế bào ở 37°C thay vì ở nhiệt độ thấp hơn. Nhiều lồi thuộc Lactococcus và Lactobacillus có hoạt tính probiotic được chứng minh sự sinh trưởng tế bào theo hàm
số mũ mà không phải ở pha lag khi được nuôi ở nhiệt độ 37°C (Åkerberg và cộng sự, 1998; Tomás và cộng sự, 2005).
Dựa vào sự sinh acid trong môi trường nuôi cấy mà có thể nhận thấy pH nuôi cấy giảm tương ứng. pH ban đầu của môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về 6,5-7,0 và giảm dần trong suốt thời gian nuôi cấy. Việc giảm đáng kể giá trị pH ở giai đoạn tăng trưởng theo hàm số mũ sau 24 giờ nuôi và duy trì trong thời gian sau đó.
Mơi trường MRS thay thế nguồn đường là lactose và saccharose, ban đầu môi trường khơng có D - Glucose, nhưng sau đó D- glucose được sinh ra do q trình sinh trưởng của vi khuẩn lactic phân giải Lactose và Saccharose, hàm lượng đường D- Glucose tăng lên do hoạt động trao đổi chất tăng theo số lượng vi khuẩn. Đến khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, đến giai đoạn hoạt động trao đổi chất giảm, một số vi sinh vật chết đi thể hiện khi nồng độ D -glucose giảm sau 32 giờ. Chính vì vậy để hiệu suất thu sinh khối cao nhất, vi sinh vật nên được thu sinh khối sau 24 giờ nuôi cấy.
3.5 Kết quả thử nghiệm lên men
TH01 là tổ hợp chủng được lựa chọn để tiến hành tối ưu hóa trước khi thử nghiệm lên men ở quy mô lớn hơn. Tỉ lệ giống, tỉ lệ chủng và nhiệt độ lên men được nghiên cứu ở quy mơ 1 lít. Sau đó quy mơ 5 lít được tiến hành thử nghiệm để so sánh sự thay đổi khi lên men ở quy mô lớn hơn.
3.5.1 Lựa chọn tỉ lệ giống bổ sung
Tỉ lệ giống khời động bổ sung vào sữa lên men ản hưởng đến quá trình lên men như thời gian kết thúc lên men, sự tạo hương vị của sữa chua và sự ổn định sau lên men. Thí nghiệm thực hiện lên men sữa với các tỉ lệ giống bổ sung lần lượt theo các cơng thức thí nghiệm như trong hình 3.16 (đơn vị % thể tích ở OD1). Kết quả đánh giá trung bình được thể hiện dưới đây:
4 5 6 7 0 4 5 6 7 8 9 pH theo thời gi an lên m en (giờ) Tỉ lệ giống TH1 CT4 CT3 CT2 CT1
Hình 3.20. pH theo thời gian lên men với các tỉ lệ giống khác nhau
Ghi chú: CT1- 5%, CT2 – 10%, CT3 - 20%, CT4 - 40%
Kết quả cho thấy cả 4 công thức cho kết quả lên men đều đạt pH 4,40 – 4,50 không quá 9 giờ. CT4 có tỉ lệ giống cao nhất, thời gian lên men ngắn (trung bình là 5 giờ) tuy nhiên trạng thái khơng được mịn và chưa có hương như CT3. Sau thời gian bảo quản sữa chua thành phẩm ở 4oC trong 3 tuần thì CT4 có pH giảm q nhanh làm mất đi vị ngon của sản phẩm. Sau thời gian bảo quả sữa chua trogn 3 tuần, sản phẩm sữa chua trong công thức 4 giảm nhiều, chất lượng sữa chua không đạt yêu cầu. Trong khi đó tỉ lệ giống trong CT3 có độ ổn định tương đối tốt. Tỉ lệ giống trong CT3 để thực hiện lựa chọn tỉ lệ chủng.