3.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic mang đặc tính probiotic có khả năng
3.1.2 Các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn lactic
Tám chủng lactic được nghiên cứu tiếp một số đặc tính probiotic như khả năng sinh axit hữu cơ, khả năng sinh enzyme β- Galactosidase, protease, khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh…
3.1.2.1 Khả năng sinh axit hữu cơ, khả năng sinh enzyme β- Galactosidase, protease
Kết quả nghiên cứu khả năng sinh axit hữu cơ, khả năng sinh enzyme β- Galactosidase, protease được trình bày trong bảng 3.2 chọn các tổ hợp bao gồm những chủng có nhiều đặc tính probiotic. Các kết quả về đặc tính probiotic các chủng nghiên cứu được trình bày dưới đây:
Bảng 3.2. Một số đặc tính probiotic của các chủng lactic
Kí hiệu chủng
Khả năng sinh axit hữu cơ (g/l) Hoạt độ β-galactosidase (nmol/phút) Protease (D, mm) M01 0,88 29,61 21 2991 0,92 76,65 10 4045 0,33 129,10 0 LA 0,46 218,58 13 3492 0,85 23,24 10 BH 0,84 23,24 27 Ca 0,68 46,37 12 8905 0,21 9,45 17
Trong bảng trên, 4 chủng có khả năng sinh axit hữa cơ cao nhất là các chủng M01, 2991, 3492 và chủng BH. Các chủng vi khuẩn lactic được nuôi trên môi trường dịch thể MRS và được đánh giá khả năng sinh enzyme β-galactosidase theo phương pháp định lượng của Miller, 1972. Hoạt tính β –galactosidase của tám chủng nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.2 . Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn lactic đều có khả năng sinh enzyme β –galactosidase trong đó các có hoạt tính β -galactosidase cao là chủng 2991 có hoạt tính β -galactosidase 76,65nmol phút; 4045 đạt 129,1nmol/phút và L đạt 218nmol/phút. Các chủng M01 và chủng BH thể hiện khả năng phân giải
cazein cao. Đây là các đặc tính có liên quan chặt chẽ đến khả năng làm đông sữa của các chủng vi khuẩn lactic. Từ các kết quả này thấy rằng 7/8 chủng có tiềm năng hơn trong khả năng lên men sữa, phân giải lactose trong sữa tạo đường dễ hấp thu. Chủng 8905 cho thấy khả năng sinh axit hữu cơ và enzyme β- Galactosidase, protease thấp.
.
Hình 3.2. Vịng phân giải cazein của chùng BH và chủng M01
3.1.2.2 Khả năng làm tan máu, khả năng chịu muối mật, chịu pH thấp, chịu điều iện ruột, dạ dày và tính kị nước trên bề mặt tế bào
Khả năng chịu muối mật
Các chủng lactic được nuôi trên mơi trường dịch thể MRS có bổ sung muối mật với các nồng độ 0,2%, 0,3%, 0,5% và 1% ở 37oC trong 24 giờ. Đối chứng là môi trường MRS không bổ sung muối mật. Theo Gilliland và cộng sự, nồng độ 0,3% là nồng độ quan trọng để sàng lọc các chủng đề kháng dựa theo nồng độ của dãy mật người từ 0,1 đến 0,3% [20,21]. Cụ thể: hai chủng M01 và 4045 khơng có dấu hiệu sống sót trên tất cả các mẫu có bổ sung muối mật, hai chủng BH và 2991 cho thấy khả năng sống sót và sinh trưởng trên mơi trường có nồng độ muối mật 0,2%. Các chủng cịn lại đều có thể tồn tại trong mơi trường có nồng độ muối mật 0,3%. Trong đó 8905 tồn tại được trên mơi trường có nồng độ muối mật 0,5%, nồng độ muối mật 1% có các chủng LA, 3492 và Ca có thể sống sót và sinh trưởng.
Đặc tính tan máu
Các chủng được cấy ria trên mơi trường MRS có bổ sung 5% máu cừu, ủ tại 37oC trong 24± 2 giờ. Kết quả cho thấy khơng có chủng nào dung huyết kiểu β (không làm tan máu).
Chịu pH thấp, chịu muối mật, tính kị nước và chịu điều kiện ruột, dạ dày
Sau 3 giờ ủ trong đệm PBS pH 2, khơng thấy dấu hiệu sống sót của 8 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu. 8 chủng vi khuẩn lactic khi ủ với PBS pH 3 trong 3 giờ cho thấy 4/8 chủng có tỉ lệ sống sót >50% là M01, 2991, 4045 và Ca.
Bảng 3.3. Khả năng chịu muối mật, chịu pH thấp và tính kị nước của các chủng lactic
Kí hiệu chủng Khả năng chịu muối mật (%)
Khả năng chịu pH thấp (%)
Chịu điều kiện dạ dày, ruột (Log CFU/ml) Tính kị nƣớc (%) M01 <0,2 81,11 2,05 42,5 2991 0,2 74,91 5,31 39,2 4045 <0,2 50,58 0 29,6 LA 1 49,66 7,12 31,5 3492 1 0,56 1,22 13,1 BH 0,2 0 0 18,3 Ca 1 86,51 8,90 37,7 8905 0,50% 49,21 5,64 31,4
Từ kết quả bảng trên cho thấy các chủng thuộc nhóm Streptococcus khơng có
khả năng chịu pH thấp. Các chủng Ca, M01 và 2991 có khả năng chịu axit cao, sau 3 giờ khả năng sống sót >80%. Với nồng độ muối mật ≥0,5% có 4 chủng có khả năng sống sót đó là các chủng Ca, M01, 2991 và chủng 4045. Và sau khi đi qua hệ dạ dày,
ruột, dưới sự tác động của axit dạ dày, muối mật và các enzyme thủy phân, các chủng M01, 2991, LA, 3492, Ca và LA tồn tại được. Trong nghiên cứu của [57]. Đây là đặc điểm có lợi của các chủng vi khuẩn lactic, khi được bổ sung và tồn tại trong hệ tiêu hóa. Giúp tăng cường khả năng miễn dịch cũng như cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột trong cơ thể đặc biệt là đối với hệ tiêu hóa của trẻ nhỏ.
Khả năng tự kết dính giúp cho vi khuẩn lactic kết dính lại với nhau để hình thành một quần thể lớn, giúp tăng cường được sức sống và sự phát triển của chủng theo kiểu mối quan hệ hỗ trợ cùng loài. Khả năng tự kết dính cịn có sự liên quan đến khả năng bám dính đường ruột và cịn làm tăng khả năng lưu lại trong đường tiêu hóa của chủng vi sinh vật.
Các chủng khác nhau có tính kị nước bề mặt tế bào là khác nhau. Khả năng bám dính vào ethyl acetate (dung mơi có tính base) phản ánh tính phân cực và tính acid của bề mặt tế bào vi khuẩn lactic. Khả năng bám dính ethyl acetate cao có khả năng kéo theo cơ hội bám dính vào những yếu tố phân cực có tính bazơ trong biểu mơ ruột. Theo Maria (2006), khả năng bám dính ethyl acetate của một số chủng L. johnsonii, L. plantarum, L. paracasei, L. casei nằm trong khoảng 0 ÷ 79,2%. Khả năng bám dính
với dung môi ethyacetate của Lb. casei cho kết quả nằm trong khoảng 10 ÷ 60%
(Provencio et al., 2009). Tính ưa nước của bề mặt tế bào vi khuẩn có thể là do các hợp chất có tính acid hoặc base trên bề mặt, hoặc có thể có cả hai. Sự bám dính của tế bào vi khuẩn với chloroform (dung mơi có tính acid) phản ánh tính base của bề mặt tế bào. Provencio và đồng tác giả (2009) cơng bố khả năng bám dính với dung mơi chloroform của. Lactobacillus casei từ 20 đến 98%. Maria (2006) đã ghi nhận khả năng bám dính chloroform của một số chủng trong các loài L. johnsonii, L. plantarum, L. paracasei, L.
casei thay đổi từ 11,6% đến 100%. Trong kết quả nghiên cứu của 8 chủng lactic này,
3.1.2.3 Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh
Khả năng sinh bacteriocin là một đặc tính quan trọng của các chủng khi nghiên cứu các vi khuẩn có lợi. Sáu chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm 4 vi khuẩn gram dương (B. cereus, Micrococcus luteus, Listeria innocua, Staphylococcus aureus) và 2 vi khuẩn gram âm (E. coli, Salmonella enterica). Kết quả đường kính vịng kháng khuẩn được ghi lại trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Kích thước vịng kháng khuẩn của các chủng lactic
(*) vòng kháng khuẩn mờ
Mic - Micrococcus luteus, Lis - Listeria innocua, Sal - Salmonella enterica, Sta - Staphylococcus aureus
Bảng trên cho thấy tất cả các chủng lactic trong nghiên cứu có phổ kháng khuẩn rộng. Chúng kháng được cả vi khuẩn gram (+) và gram (-). Trong đó 4 chủng có khả năng kháng khuẩn tốt nhất là M01, 2991, Ca (kháng 6/6 chủng kiểm định) và Ca (kháng 5/6 chủng kiểm định). Nhờ đó, sự tồn tại của các chủng vi khuẩn lactic này trong sữa lên men làm cho sữa trở thành thực phẩm dinh dưỡng an tồn, có lợi cho sức khỏe. Đặt biệt, khi chúng có thể tổn tại trong hệ đường ruột của người sẽ ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như E.coli, S. aureus, S. enterica… Hiện nay, các chủng vi khuẩn kháng chất kháng sinh ngày càng nhiều, vì vậy thay thế sử dụng thuốc kháng
KH chủng
Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (D ±1, mm)
B. cereus E. coli Mic Lis Sal Sta
Dịch nuôi PH 6,5 Dịch nuôi PH 6,5 Dịch nuôi PH 6,5 Dịch nuôi PH 6,5 Dịch nuôi PH 6,5 Dịch nuôi PH 6,5 M01 14 12 13* 10* 31 24 14 13 14 0 17 13 2991 15 13 16 12 35 29 17 13 14 13 15 15 4045 0 0 0 0 17 14 13 9 0 0 12 12 LA 13 11 0 0 25 19 15 11 0 0 16 10 3492 7 6 12* 10* 24 21 10 6 0 0 10 0 BH 13 11 13 11 30 30 13 12 0 0 12 14 Ca 15 14 12* 10* 36 25 16 14 13 10 17 15 8905 11 8 0 0 28 21 11 0 7 0 12 0
sinh bằng các sản phẩm probiotic là một biện pháp hiệu quả hơn. Trong kết quả nghiên cứu trên, kích thước vịng kháng vi khuẩn kiểm định của dịch nuôi khi được chỉnh pH có giảm 1-5mm so với dịch nuôi ban đầu. Điều này cho thấy trong quá trình sinh trưởng của các vi khuẩn lactic, việc sinh axit làm giảm pH của môi trường cũng ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên, khả năng sinh bacteriocin của các chủng trong nghiên cứu cũng thể hiện rất rõ ràng.
Hình 3.3.Vịng kháng M. luteus của các chủng vi khuẩn lactic đại diện
Hình 3.4 Vịng kháng L. innocua của chủng 2991 (A) Vịng kháng dịch ni ban đầu (A) Vịng kháng dịch ni ban đầu
Ngày nay, bacteriocin đã được sử dụng rộng rãi, đặc biệt trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm như sữa, trứng, rau và thịt. Và bacteriocin từ các chủng vi khuẩn lactic đã được chứng minh là hiệu quả cao trong việc chống lại các bệnh gây ngộ độc thực phẩm và hư hỏng thực phẩm. Có thể ứng dụng bacteriocin bằng cách sử dụng thực phẩm lên men bởi các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin. Chủng giống khởi động trong lên men sữa có đặc tính sinh bacteriocin giúp tạo ra thực phẩm dinh dưỡng an tồn, có lợi cho sức khỏe. Ngồi ra, lợi ích của việc sử dụng giống khởi động có hoạt tính bacteriocin cao cũng hỗ trợ qua trình bảo quản các sản phẩm thực phẩm được hiệu quả, tiết kiệm chi phí hơn. Trong số các vi khuẩn lactic sản xuất bacteriocin, câc chủng thuộc chi Lactobacillus được đặt biệt chú ý [78].
Trong tám chủng nghiên cứu, ba chủng thuộc chi Lactobacillus cho thấy khả
năng sinh bacteriocin cao là M01, 2991 và Ca (vòng kháng ≥20mm đối với
Micrococcus luteus). Theo tổng hợp của Ahmed (2010), bacteriocin do các chủng L. acidophilus là acidophilucin, acidocin và lactacin [8]. L. casei là vi khuẩn an tồn, tìm
thấy nhiều trong ruột người và động vật. L. casei sinh caseicin, lactocin [78]. L. bulgarricus cũng là lồi có hoạt tính bacteriocin cao (Tail và công sự 2011). Trong nghiên cứu này, chủng BH thuộc chi Sreptococcus cũng cho kết quả kháng vi sinh vật kiểm định cao. Ngồi ra cịn có rất nhiều loài vi khuẩn lactic khác cũng sinh bacteriocin như L. johnsonii sinh Lactacin F, L. lactis sinh Lactoccin G , Lactococcus
lactis sinh Nisin [78]. Đã có rất nhiều báo cáo nghiên cứu đều cho thấy khả năng kháng
vi sinh vật gây bệnh cao của các vi khuẩn lactic. Vitali và cộng sự (2012) phân lập được các loài LAB khác nhau (90 phân lập) từ oliu sản xuất các chất chống khuẩn chống vi khuẩn gây bệnh gram âm và gram dương như S. aureus. E. facalis, Salmonella enterica. Nghiên cứu khác của Messaoudi (2012) cho thấy bacteriocin của
các chủng lactic phân lập từ gà ức chế chống lại một số mầm bệnh gây ra bởi thực phẩm như L.monocytogenes, S.aureus và Salmonella mà không ức chế LAB [77].
3.1.2.5 Khả năng kháng chất kháng sinh
Các vi khuẩn lactic được nuôi qua đêm trên môi trường dịch thể MRS. Khả năng kháng chất kháng sinh được đánh giá bằng phương pháp đặt khoanh giấy kháng sinh. Vi khuẩn được ghi nhận là kháng kháng sinh nếu khơng xuất hiện vịng kháng.
Thí nghiệm được thực hiện với 5 loại kháng sinh ampicillin (amp-10µg/l), amoxicillin (amo-10µg/l), cefalexin (cef -30µg), chloramphenicol (chl-30µg/l), tetracycline (tet-30µg) 65. Đối chứng là khoanh giấy khơng tẩm kháng sinh. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.5
Bảng 3.5. Khả năng kháng chất kháng sinh của các chủng vi khuẩn lactic
Nhóm chủng KH
Đƣờng kính vịng kháng (mm)
Ap10 Am10 C30 Ch30 T30 Đối
chứng L. bulgaricus M01 26 26 0 0 20 0 L. acidophilus 2991 23 22 0 0 20 0 4045 29 30 0 0 27 0 LA 25 28 0 0 28 0 S. thermophilus 3492 28 30 0 0 22 0 BH 33 37 0 0 26 0 L. casei Ca 26 23 0 0 19 0 L. sakei 8905 30 28 0 0 25 0
Ghi chú: Ap10 : Ampicillin (10µg/l); Am10 : Amoxicilline (10µg/l); T30:Tetracycline (30µg/l); Ch30 : Chloramphenicol (30µg/l), C30: cefalexin (30µg/l).
Hiện nay tính kháng kháng sinh của vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu nhiều do vấn đề thực phẩm từ động vật có chứa chất kháng sinh, từ đó có thể gây xuất hiện ngày càng nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng lại kháng sinh. Điều đáng lo ngại của các nhà khoa học là những vi sinh vật này có thể chuyển gen kháng kháng sinh cho các vi khuẩn có hại. Nghiên cứu tính an tồn của các chủng probiotic, người ta cũng lưu ý đến việc chủng đó có mang gen kháng kháng sinh hay không. Các nghiên cứu từ rất lâu trước đây đã cho thấy khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi
khuẩn lactic như nghiên cứu của Marth và cộng sự (1959), Renbold và cộng sự (1974) và nghiên cứu của Sozzi (1980) còn cho thấy sự gia tăng khả năng kháng kháng sinh của các chủng S. thermophilus và L. bulgaricus so với các nghiên cứu trước đó [69].
Kết quả nghên cứu này cho thấy cả 8 chủng thể hiện tính kháng cefalexin và chloramphenicol và nhạy cảm với ampicillin, amoxicillin, tetracycline. Các nghiên cứu của Danielsen và Wind (2003), Coppola và cộng sự (2005) chỉ ra rằng thành tế bào của các loài Lactobacillus dễ bị tổn thương bởi các chất ức chế tổng hợp như penicillin và ampicillin. Kết quả này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của Gamal và cộng sự (2014) là các chủng lactic nhạy cảm cao với ampicillin và amoxicillin. Đối với kháng sinh ức chế tổng hợp protein như chloramphenicol, các lồi Lactobacillus có khả năng kháng lại chúng theo nghiên cứu của các tác giả Coppola và cộng sự (2005), Klare và cộng sự (2007). Trong nghiên cứu này, cả 8 chủng nghiên cứu đều cho thấy khả năng kháng lại chloramphenicol 30µg/l. Korhonen và cộng sự (2008), Hoque và cộng sự (2010) cho rằng các lồi Lactobacillus có sự đề kháng khác nhau đối với tetracyclin, kết quả nghiên cứu 8 chủng này cũng đồng ý với ý kiến trên. Có lẽ, sự biến đổi rộng rãi của cơ chế kháng tetracyclin mang lại mức độ nhạy cảm đa dạng của các chủng lactic với tetracyclin(Roberts 2005).
Các gen kháng kháng sinh của L đã được mô tả và xem xét trong nghiên cứu củaAmmor và cộng sự (2007). Hai trong số những gen kháng kháng sinh phổ biến nhất được tìm thấy trong LAB là tet (M) đối với tính kháng tetracyclin và erm ( ) đối với erythromycin, tiết theo là các gen cat mã hóa kháng chloramphenicol (Lin và cộng sự, 1996, Danielsen ,2002, Gevers và cộng sự, 2003, Cataloluk and Gogebaka,2004). Nawaz et al. (2011) báo cáo rằng trong số 84 chủng LAB, gen erm ( ) được phát hiện ở 08 chủng thuộc Lactobacillus và 01chủng Streptococcus thermophilus. Các gen tet
đã được xác định trong 12 chủng lactobacilli từ thực phẩm truyền thống. Trong nghiên cứu của một số tác giả thì khả năng kháng kháng sinh của các lồi vi khuẩn lactic được giải thích nhờ cấu trúc thành tế bào hoặc màng tế bào chống thấm hoặc theo một vài cơ
chế khác. Việc sử dụng các chủng vi khuẩn probiotic lactic này kết hợp với việc điều trị bệnh cần sử dụng kháng sinh sẽ khắc phục được những tác động không mong muốn do kháng sinh mang lại.
3.1.2.4 Khả năng sinh trưởng của các chủng LAB
Theo dõi mật độ LAB ở các thời điểm 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ, 27 giờ và 30 giờ định lượng mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch. Mật độ cấy ban đầu là 1,9 - 2,1.105 CFU/ml.
Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của các chủng LAB
Kết quả cho thấy 6/8 chủng có khả năng sinh trưởng tốt đạt trên 108 CFU/ml, hai chủng LA và 4045 có khả năng sinh trưởng kém hơn trên MRS. Chủng 3492 có khả năng tạo sinh khói tốt nhất đạt 7,8.1011 sau 24 giờ nuôi cấy. Lựa chọn những chủng có khả năng sinh trưởng tốt có thể tạo điều kiện dễ dàng hơn trong việc nghiên cứu tiếp theo và tiết kiệm chi phí sản xuất sau này. Vì vậy, khi lựa chọn chủng lactic cho ứng dụng làm giống khởi động, ngồi các đặc điểm probiotic khác, chủng nào có khả năng