2.5.1 Nghiên cứu mơi trƣờng ni cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi tĩnh trên 8 môi trường: MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT7, MRS, ủ 37oC trong 24 giờ. Tiến hành đo OD600 để xác định mật độ tế bào. Dựa vào kết quả chọn lọc môi trường tối ưu cho các thử nghiệm tiếp theo.
2.5.2 Nghiên cứu điều kiện cung cấp khí thích hợp
Các chủng nghiên cứu được nuôi trong mơi trường tối ưu trong ống nghiệm có nắp vặn (điều kiện tĩnh), và điều kiện hiếu khí trong bình tam giác 150ml với 25ml dịch mơi trường, lắc 200 vịng phút với các điều kiện đã tối ưu. Sau 24h, xác định mật độ tế bào (OD600)
2.5.3 Nghiên cứu nhiệt độ ni thích hợp
Ni tĩnh vi khuẩn trong mơi trường thích hợp ở 7 điều kiện nhiệt độ: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC. Xác định pH sau nuôi và mật độ tế bào(OD600). Từ kết quả thu được chọn nhiệt độ tốt nhất cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.5.4 Nghiên cứu pH ni thích hợp
Chủng vi khuẩn được ni tĩnh trong mơi trường thích hợp, nhiệt độ thích hợp, pH của mơi trường được chỉnh ở các giá trị: 4, 5, 6, 7, 8, 9. Sau thời gian 24 giờ, xác định mật độ tế bào (OD600), pH sau nuôi.
2.5.5 Nghiên cứu nguồn cacbon thích hợp
Chủng vi khuẩn được ni cấy trong mơi trường với các điều kiện thích hợp. Thay các nguồn C trong môi trường bằng các nguồn C khác: fructose, galactose, lactose, maltose, manitol, saccharose. Sau 24 giờ, xác định mật độ tế bào (OD600) và pH sau ni.
2.5.6 Lựa chọn nguồn N thích hợp
cao thịt, peptone, tryptone, Ure, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNO2. Sau 24h, xác định mật độ tế bào (OD600) và pH sau ni.
2.5.7 Lựa chọn thời gian ni thích hợp
Ni các chủng vi khuẩn trên môi trường và điều kiện thích hợp đã chọn. Sau thời gian 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48 và 60 giờ. Xác định số lượng tế bào, pH sau nuôi và hàm lượng D-glucose trong môi trường
Phương pháp định lượng Glucose 1. Hóa chất
DNS (Merck), RO salt (Merck), NaOH (Merck), Phenol tinh thể, NaHCO3, Tinh bột tan, Tris-base, HCl, D- glucose
2. Pha thuốc thử DNS
Dung dịch A: Dung dịch DNS 1% : Cân 4g DNS hòa tan trong 400 ml nước cất. Cân 127,5g RO salt hòa tan trong DNS 1%. NaOH 4,5% : Cân 6,75g NaOH hòa tan trong 150 ml nước cất. Trộn dung dịch trên được dung dịch A, màu vàng,trong suốt.
Dung dịch B.: NaOH 10%: cân 1,1g NaOH hòa tan trong 10 ml nước cất. Cân 5g phenol tinh thể hòa tan trong NaOH 10%. Rồi dẫn nước đến 50ml. Cân 3,45 g NaHCO3 hòa tan trong 34,5 ml dung dịch phenol ở trên, thu được dung dịch B Trộn 2 dung dịch A và B vào bình tối màu, sau 2 ngày là dùng được
Chú ý: nếu dung dịch xuất hiện tủa phải lọc qua giấy lọc.
3. Dựng đường chuẩn glucose
D-glucose được sấy khô ở 105oC trong 2 giờ. Cân 0,2g D- glucose trong 10ml nước cất- được stock solution 20mg ml. Hút 1ml stock solution vào 9ml nước cất – được stock solution 1 có nồng độ 1 có nồng độ 2mg/ml. Dùng stock solution 1 để pha loãng thành các dãy nồng độ sau từ 0; 0,2; 0,4;…; 2 mg/ml
Cách dựng đường chuẩn
Bổ sung 0,6 ml DNS
Đun sôi hỗn hợp trong vòng 5 phút Làm lạnh nhanh trong nước đá 5 phút
Để hỗn hợp có nhiệt độ bằng nhiệt độ phịng, bổ sung 4,2 ml nước cất. Đo hỗn hợp OD575 nm, dùng Blank là mẫu có nồng độ 0 mg/ml.
Lặp lại thí nghiệm 2 lần để thu được giá trị OD1 và OD2.
Bảng 2.2. Mật độ quang phổ (OD575) ở các nồng độ glucose khác nhau
Nồng độ (mg/ml) Stock solution 1(µl) Nƣớc cất (µl) OD1 575 nm OD2 575 nm 0 0 1000 Blank Blank 0,2 100 900 0,034 0,112 0,4 200 800 0,141 0,24 0,6 300 700 0,237 0,392 0,8 400 600 0,426 0,5 1 500 500 0,536 0,62 1,2 600 400 0,643 0,737 1,4 700 300 0,785 0,896 1,6 800 200 0,86 0,969 1,8 900 100 0,996 1,071 2 1000 0 1,119 1,213
Từ bảng 2, ta lập được Phương trình tuyến tính là Y=1,673*X+0,047 với R=0,998, Y là nồng độ D-glucose (mg/ml), X là giá trị OD 575nm.
Mẫu thí nghiệm : Làm tương tự với các mẫu đối chứng, đo OD 575 sau 0, 8,
16, 24, 32, 40, 48 và 60 giờ, từ đó dựa vào phương trình tuyến tính, tính ra được lượng D - glucose trong q trình ni cấy.
2.6 Thử nghiệm lên men quy mơ 5 lít
2.6.1 Nghiên cứu tỉ lệ giống khởi động
Các chủng vi khuẩn LAB được nhân giống trong các điều kiện thích hợp. Sau 24 giờ, thu dịch nuôi cấy, đo OD600, sử dụng các tỉ lệ giống khác nhau. Tiến hành lên men sữa ở 42oC. Đánh giá, lựa chọn tỉ lệ giống thích hợp sản phẩm sữa chua có hương vị tốt, thời gian lêm men đạt yêu cầu.
2.6.2 Nghiên cứu tỉ lệ thành phần chủng trong tổ hợp
Sử dụng tỉ lệ giống được chọn, thay tổi tỉ lệ thành phần các chủng trong tổ hợp được lựa chọn. Tiến hành lên men, đánh giá cảm quan sau 3 ngày. Lựa chọn tỉ lệ chủng cho thành phẩm sữa chua có trạng thái hương vị tốt nhất trong thời gian lên men không quá 9 giờ.
2.6.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình lên men
Lên men sữa quy mô 1 lít tại nhiệt độ 36oC, 39oC ,42oC và 45oC theo tỉ lệ chủng, tỉ lệ giống lựa chọn từ thử nghiệm trên. Đánh giá sản phẩm sữa chua có hương vị tốt, thời gian lêm không quá 9 giờ.
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic mang đặc tính probiotic có khả năng lên men sữa năng lên men sữa
Các chủng vi khuẩn lactic lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam (VTCC) được hoạt hóa trên mơi trường thạch đĩa MRS. Tám chủng lactic thuộc hai chi Lactobacillus và Streptococcus được lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm đánh giá khả năng lên men sữa và nghiên cứu các đặc tính probiotic. Trong đó có sáu chủng thuộc chi Lactobacillus là các chủng: M01, 2991, 4045, LA, Ca, 8905 và hai chủng
thuộc chi Streptococcus là 3492 và BH.
3.1.1 Khả năng lên men sữa của các chủng vi khuẩn lactic
Để đánh giá khả năng lên men sữa của các chủng vi khuẩn lactic (LAB), chúng tôi khảo sát khả năng lên men đường lactose và khả năng làm đông sữa của chúng.
3.1.1.1 Khả năng phân giải đường lactose
Kết quả sau 48 giờ, dịch nuôi của cả 8 chủng L đổi màu từ đỏ sang cam, vàng cho thấy cả 8 chủng đều có khả năng lên men đường lactose. Các chủng vi khuẩn lactic sử dụng lactose trong sữa tạo ra axit lactic, pH dịch nuôi giảm làm đổi màu chỉ thị red phenol.
3.1.1.2 Khả năng làm đông sữa
Các chủng vi khuẩn lactic được đánh giá khả năng làm đơng sữa qua hai thí nghiệm là khả năng làm đông sữa của enzyme ngoại bào và khả năng làm đơng sữa trong q trình sinh trưởng. Kết quả cho thấy:
Dịch enzyme ngoại bào nuôi cấy sau 48 giờ của các chủng vi khuẩn lactic khi được bổ sung vào dung dịch sữa (Skim milk 100g/l, CaCl2 1,5g/l) ủ tại 40oC đều cho kết quả làm đông sữa sau 15 giờ. Kết quả này chứng minh rằng tám chủng vi khuẩn lactic trên đều sinh ra enzyme ngoại bào có tác động làm đơng sữa.
Thí nghiệm thứ hai là đánh giá khả năng làm đông sữa của các chủng vi khuẩn lactic trong q trình sinh trưởng. Kết quả làm đơng sữa khi cấy sinh khối các chủng vi khẩn lactic trực tiếp vào trong 10ml sữa ủ tại 42oC, sau 10 giờ thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.1. Khả năng làm đông sữa của các chủng vi khuẩn lactic
STT Kí hiệu
chủng OD600
KN
đơng tụ STT Kí hiệu chủng OD600
KN đông tụ 1 M01 2,18 ++ 5 3492 2,09 ++++ 2 2991 2,53 +++ 6 BH 2,07 ++ 3 4045 1,49 ++ 7 Ca 2,98 +++ 4 LA 1,54 ++ 8 8905 1,76 ++
Ch thích Đơng chậm ; Đông chậm, tách nước Đông nhanh, tách nước Đông nhanh, mịn
Từ bảng kết quả trên cho thấy 8 chủng vi khuẩn lactic có khả năng làm đơng sữa khác nhau. Trong đó, ba chủng có khả năng làm đơng sữa tốt nhất là chủng 3492 thuộc chi Streptococcus, hai chủng 2991 và Ca thuộc chi Lactobacillus.
3.1.2 Các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn lactic
Tám chủng lactic được nghiên cứu tiếp một số đặc tính probiotic như khả năng sinh axit hữu cơ, khả năng sinh enzyme β- Galactosidase, protease, khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh…
3.1.2.1 Khả năng sinh axit hữu cơ, khả năng sinh enzyme β- Galactosidase, protease
Kết quả nghiên cứu khả năng sinh axit hữu cơ, khả năng sinh enzyme β- Galactosidase, protease được trình bày trong bảng 3.2 chọn các tổ hợp bao gồm những chủng có nhiều đặc tính probiotic. Các kết quả về đặc tính probiotic các chủng nghiên cứu được trình bày dưới đây:
Bảng 3.2. Một số đặc tính probiotic của các chủng lactic
Kí hiệu chủng
Khả năng sinh axit hữu cơ (g/l) Hoạt độ β-galactosidase (nmol/phút) Protease (D, mm) M01 0,88 29,61 21 2991 0,92 76,65 10 4045 0,33 129,10 0 LA 0,46 218,58 13 3492 0,85 23,24 10 BH 0,84 23,24 27 Ca 0,68 46,37 12 8905 0,21 9,45 17
Trong bảng trên, 4 chủng có khả năng sinh axit hữa cơ cao nhất là các chủng M01, 2991, 3492 và chủng BH. Các chủng vi khuẩn lactic được nuôi trên môi trường dịch thể MRS và được đánh giá khả năng sinh enzyme β-galactosidase theo phương pháp định lượng của Miller, 1972. Hoạt tính β –galactosidase của tám chủng nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.2 . Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn lactic đều có khả năng sinh enzyme β –galactosidase trong đó các có hoạt tính β -galactosidase cao là chủng 2991 có hoạt tính β -galactosidase 76,65nmol phút; 4045 đạt 129,1nmol/phút và L đạt 218nmol/phút. Các chủng M01 và chủng BH thể hiện khả năng phân giải
cazein cao. Đây là các đặc tính có liên quan chặt chẽ đến khả năng làm đông sữa của các chủng vi khuẩn lactic. Từ các kết quả này thấy rằng 7/8 chủng có tiềm năng hơn trong khả năng lên men sữa, phân giải lactose trong sữa tạo đường dễ hấp thu. Chủng 8905 cho thấy khả năng sinh axit hữu cơ và enzyme β- Galactosidase, protease thấp.
.
Hình 3.2. Vịng phân giải cazein của chùng BH và chủng M01
3.1.2.2 Khả năng làm tan máu, khả năng chịu muối mật, chịu pH thấp, chịu điều iện ruột, dạ dày và tính kị nước trên bề mặt tế bào
Khả năng chịu muối mật
Các chủng lactic được nuôi trên mơi trường dịch thể MRS có bổ sung muối mật với các nồng độ 0,2%, 0,3%, 0,5% và 1% ở 37oC trong 24 giờ. Đối chứng là môi trường MRS không bổ sung muối mật. Theo Gilliland và cộng sự, nồng độ 0,3% là nồng độ quan trọng để sàng lọc các chủng đề kháng dựa theo nồng độ của dãy mật người từ 0,1 đến 0,3% [20,21]. Cụ thể: hai chủng M01 và 4045 khơng có dấu hiệu sống sót trên tất cả các mẫu có bổ sung muối mật, hai chủng BH và 2991 cho thấy khả năng sống sót và sinh trưởng trên mơi trường có nồng độ muối mật 0,2%. Các chủng cịn lại đều có thể tồn tại trong mơi trường có nồng độ muối mật 0,3%. Trong đó 8905 tồn tại được trên mơi trường có nồng độ muối mật 0,5%, nồng độ muối mật 1% có các chủng LA, 3492 và Ca có thể sống sót và sinh trưởng.
Đặc tính tan máu
Các chủng được cấy ria trên mơi trường MRS có bổ sung 5% máu cừu, ủ tại 37oC trong 24± 2 giờ. Kết quả cho thấy khơng có chủng nào dung huyết kiểu β (không làm tan máu).
Chịu pH thấp, chịu muối mật, tính kị nước và chịu điều kiện ruột, dạ dày
Sau 3 giờ ủ trong đệm PBS pH 2, khơng thấy dấu hiệu sống sót của 8 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu. 8 chủng vi khuẩn lactic khi ủ với PBS pH 3 trong 3 giờ cho thấy 4/8 chủng có tỉ lệ sống sót >50% là M01, 2991, 4045 và Ca.
Bảng 3.3. Khả năng chịu muối mật, chịu pH thấp và tính kị nước của các chủng lactic
Kí hiệu chủng Khả năng chịu muối mật (%)
Khả năng chịu pH thấp (%)
Chịu điều kiện dạ dày, ruột (Log CFU/ml) Tính kị nƣớc (%) M01 <0,2 81,11 2,05 42,5 2991 0,2 74,91 5,31 39,2 4045 <0,2 50,58 0 29,6 LA 1 49,66 7,12 31,5 3492 1 0,56 1,22 13,1 BH 0,2 0 0 18,3 Ca 1 86,51 8,90 37,7 8905 0,50% 49,21 5,64 31,4
Từ kết quả bảng trên cho thấy các chủng thuộc nhóm Streptococcus khơng có
khả năng chịu pH thấp. Các chủng Ca, M01 và 2991 có khả năng chịu axit cao, sau 3 giờ khả năng sống sót >80%. Với nồng độ muối mật ≥0,5% có 4 chủng có khả năng sống sót đó là các chủng Ca, M01, 2991 và chủng 4045. Và sau khi đi qua hệ dạ dày,
ruột, dưới sự tác động của axit dạ dày, muối mật và các enzyme thủy phân, các chủng M01, 2991, LA, 3492, Ca và LA tồn tại được. Trong nghiên cứu của [57]. Đây là đặc điểm có lợi của các chủng vi khuẩn lactic, khi được bổ sung và tồn tại trong hệ tiêu hóa. Giúp tăng cường khả năng miễn dịch cũng như cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột trong cơ thể đặc biệt là đối với hệ tiêu hóa của trẻ nhỏ.
Khả năng tự kết dính giúp cho vi khuẩn lactic kết dính lại với nhau để hình thành một quần thể lớn, giúp tăng cường được sức sống và sự phát triển của chủng theo kiểu mối quan hệ hỗ trợ cùng loài. Khả năng tự kết dính cịn có sự liên quan đến khả năng bám dính đường ruột và cịn làm tăng khả năng lưu lại trong đường tiêu hóa của chủng vi sinh vật.
Các chủng khác nhau có tính kị nước bề mặt tế bào là khác nhau. Khả năng bám dính vào ethyl acetate (dung mơi có tính base) phản ánh tính phân cực và tính acid của bề mặt tế bào vi khuẩn lactic. Khả năng bám dính ethyl acetate cao có khả năng kéo theo cơ hội bám dính vào những yếu tố phân cực có tính bazơ trong biểu mơ ruột. Theo Maria (2006), khả năng bám dính ethyl acetate của một số chủng L. johnsonii, L. plantarum, L. paracasei, L. casei nằm trong khoảng 0 ÷ 79,2%. Khả năng bám dính
với dung môi ethyacetate của Lb. casei cho kết quả nằm trong khoảng 10 ÷ 60%
(Provencio et al., 2009). Tính ưa nước của bề mặt tế bào vi khuẩn có thể là do các hợp chất có tính acid hoặc base trên bề mặt, hoặc có thể có cả hai. Sự bám dính của tế bào vi khuẩn với chloroform (dung mơi có tính acid) phản ánh tính base của bề mặt tế bào. Provencio và đồng tác giả (2009) cơng bố khả năng bám dính với dung mơi chloroform của. Lactobacillus casei từ 20 đến 98%. Maria (2006) đã ghi nhận khả năng bám dính chloroform của một số chủng trong các loài L. johnsonii, L. plantarum, L. paracasei, L.
casei thay đổi từ 11,6% đến 100%. Trong kết quả nghiên cứu của 8 chủng lactic này,
3.1.2.3 Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh
Khả năng sinh bacteriocin là một đặc tính quan trọng của các chủng khi nghiên cứu các vi khuẩn có lợi. Sáu chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm 4 vi khuẩn gram dương (B. cereus, Micrococcus luteus, Listeria innocua, Staphylococcus aureus) và 2 vi khuẩn gram âm (E. coli, Salmonella enterica). Kết quả đường kính vịng kháng khuẩn được ghi lại trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Kích thước vịng kháng khuẩn của các chủng lactic
(*) vòng kháng khuẩn mờ
Mic - Micrococcus luteus, Lis - Listeria innocua, Sal - Salmonella enterica, Sta - Staphylococcus aureus
Bảng trên cho thấy tất cả các chủng lactic trong nghiên cứu có phổ kháng khuẩn rộng. Chúng kháng được cả vi khuẩn gram (+) và gram (-). Trong đó 4 chủng có khả năng kháng khuẩn tốt nhất là M01, 2991, Ca (kháng 6/6 chủng kiểm định) và Ca (kháng 5/6 chủng kiểm định). Nhờ đó, sự tồn tại của các chủng vi khuẩn lactic này trong sữa lên men làm cho sữa trở thành thực phẩm dinh dưỡng an tồn, có lợi cho sức khỏe. Đặt biệt, khi chúng có thể tổn tại trong hệ đường ruột của người sẽ ức chế các vi