Kết quả xácđịnh cấu trúc hóa học các hợpchất phân lập đƣợc

Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng chấtbột màu trắng. Các phổ cộng

hưởng từ hạt nhân(NMR) của nó đặc trưng cho một hợp chấttriterpene dạng khung holostan, một lớp chất đặctrưng của các loài hải sâm[8]. Trên phổ 13C-NMR xuất hiện 59 tín hiệu cacbon cho phép dựđốn hợp chất này là một tritecpen saponin có chứa năm đơn vị đường (Hình 3.1 và Bảng 3.1, 3.2).

Hình 3.1: Phổ 13C-NMR của chất 1

Nhận định này đượckhẳng định bởi sự xuất hiện các tín hiệu của 05cacbon anome tại δC 104,85 (C-1′), 102,03 (C-1′′), 104,26 (C-1′′′), 105,00 (C-1′′′′) và

105,64(C-1′′′′′). Phân tích chi tiết các kết quả phổcộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC,HMBC và COSY(Hình 3.3, 3.4 và 3.5) cho phép gán chính xác sốliệu phổ

1H và 13C-NMR của năm đơn vị đường(xem bảng 4.1, 4.2). Các số liệu phổ này hoàn toàn tương tự như các số liệu phổ tương ứng của hợpchất cucumarioside A3[5] cho phép xác địnhchuỗi năm đơn vị đường là 3-O-methyl-β-D-glucopyranosyl- (13)-6-O-sulfate-β-D-glucopyranosyl-(14)-[β-D-xylopyranosyl-(12)]-β-D- uinopyranosyl-(12)-4-O-sulfate-β-D-xylopyranoside.

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR 125 MHz, Pyridine-d5) phần aglycon của các hợp chất 1, 2 và các chất tham khảo

aδC của hợp chất colochiroside A [3], bδC của hợp chất philinopside A [6].

C aδC 1 bδC 2 δC δH(J = Hz) δC δH(J = Hz) 1 36,4 36,06 1,35 m/1,74 m 35,8 36,12 1,44 m 2 27,0 26,74 1,84 m/2,08 m 26,8 27,15 1,91 m/2,12 m 3 88,9 88,54 3,15 dd (3,5, 11,5) 88,1 89,13 3,28 dd (3,0, 11,0) 4 39,8 39,80 - 39,8 39,61 - 5 53,0 52,72 0,86 d (12,0) 47,7 48,02 1,04 t (7,5) 6 21,2 20,96 1,45 m/1,65 m 22,4 23,76 2,02 m/2,08 m 7 28,6 28,35 1,20 m/1,55 m 120,5 120,42 5,68 br s 8 36,3 38,58 3,20 m 145,6 145,72 - 9 151,4 151,11 - 47,3 47,18 3,49 m 10 40,1 39,54 - 35,7 35,62 - 11 111,2 110,96 5,26 br d (5,0) 22,4 22,64 1,52 m/1,80 m 12 32,2 31,97 2,43 dd (5,0, 17,5)/2,56 br d (17,5) 30,20 31,41 2,00 m/2,18 m 13 55,8 55,63 - 59,5 59,31 - 14 42,1 41,93 - 47,6 47,56 - 15 52,2 51,91 2,20 d (16,0)/2,37 d (16,0) 43,5 43,71 1,75 m/2,63 m 16 213,1 213,32 - 73,9 75,02 5,97 dt (8,5, 9,0) 17 61,5 61,23 2,79 s 53,8 54,55 2,66 d (9,0) 18 176,1 176,12 - 179,6 179,56 19 22,2 21,91 1,30 s 24,2 24,03 1,23 s 20 83,2 83,19 - 85,2 85,02 - 21 26,9 26,65 1,37 s 28,9 28,33 1,53 s 22 39,2 38,91 1,55 m/1,72 m 38,8 38,79 1,92 m/2,59 m 23 22,2 21,99 1,55 m 24,2 23,33 2,02 m/2,08 m 24 39,4 39,14 1,04 m 124,4 124,22 5,12 25 28,0 27,97 1,50 m 132,1 131,94 - 26 22,6 22,46 0,78 d (6,5) 25,7 25,59 1,67 s 27 22,6 22,43 0,76 d (6,5) 17,9 17,64 1,60 s 30 16,9 17,89 1,04 s 17,5 17,35 1,14 s 31 28,2 27,79 1,21 s 28,9 28,70 1,30 s 32 20,7 20,54 0,87 s 32,4 32,26 1,17 s OAc 169,9 169,83 - OAc 21,5 21,10 2,01 s

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất 1

Hình 3.3: Phổ HSQC của chất 1

Sự có mặt và vị trí của một nhóm sulphat tạiC-4 của đơn vị đường thứ nhất (xylose) đượcchứng minh bằng các tín hiệu đặc trưng của đơnvị đường này tại

δC75,61 (C-3), 76,08 (C-4) và64,38 (C-5) với hiệu ứng ảnh hưởng α và β (tương tự

như trong trường hợp của hợp chấtcucumarioside A3 tại δC 75,7 (C-3), 76,2 (C-4)

và 64,7 (C-5)[5]) so với các giá trị tương ứngcủa đơn vị đường xylose không chứa nhómsulphat của các dẫn xuất desulphat củacucumarioside A3 tại δC 77,7 (C-3),

70,7 (C-4)và 66,4 (C-5) [5]và cucumarioside A8 tại δC78,1 (C-3), 70,6 (C-4) và 66,6 (C-5)[15].

Hình 3.4: Phổ HMBC của chất 1

Tínhiệu C-6 của đơn vị đường thứ ba (glucose) bịdịch chuyển mạnh về phía vùng trường thấp tạiδC 67,3 (C-6)/ δH 4,60 và 5,05 (H-6) tương tựnhư trường hợp của các hợp chất cucumariosideA3 và colochiroside A [21], khẳng định vịtrí của nhóm sulphat thứ hai tại C-6′′′.

Ngoài ra,các tương tác xaHMBC (Hình 3.4) nhận được của anome H-1′′′′′ (δH 5,22) với C-2′′ (δC 82,84), H-1′′′′ (δH 5,23) với C-3′′′ (δC 86,46), H-1′′′ (δH 4,75) với C-4′′ (δC 86,65), H-1′′ (δH 5,30) vớiC-2′ (δC 81,33) và tương tác của H-1′ (δH 4,71)với C-3 (δC 88,5) chứng minh trình tự liên kếtcủa các đơn vị đường và và vị trí gắn của chuỗinăm đường tại C-3 của aglycon.

Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR phầnaglycon của chất 1 (Bảng 3.1) chứng minh sự có mặt của mộtnhóm oximetin [δC 88,54 (C-3)/δH 3,15 (1H, dd,J = 3,5,

11,5 Hz, H-3)], một liên kết đơi bị thếba vị trí [δC 151,11 (s, C-9) và 110,96 (d, C- 11)/δH 5,26 (1H, br d, J = 5,0 Hz, H-11)], hai nhóm carbonyl [δC 213,32 (C-16) và 176,12(C-18)], một carbon bậc bốn mang oxi [δC83,19 (C-20)], năm nhóm metyl bậc ba [δC21,91 (C-19), 26,65 (C-21), 17,98 (C-30), 27,79(C-31) và 20,54 (C- 32)/δH 1,30 (H-19), 1,37(H-21), 1,04 (H-30), 1,21 (H-31) và 0,87 (H-32), mỗi tín hiệu 3H, s] và hai nhóm metyl bậc hai [δC 22,46 (C-26) và 22,43 (C-27)/δH 0,78(H- 26) và 0,76 (H-27), mỗi tín hiệu 3H, d, J =6,5 Hz].

So sánh số liệu phần aglycon của chất 1 với các số liệu tương ứng của hợp chất colochiroside A, kết hợp với phân tích chitiết các tương tác trên phổ COSY và HMBC cho phép xác định chính xác cấu trúcphẳng của hợp chất 1.

Hình 3.5: Phổ COSY của chất 1

Tín hiệu proton H-3 xuất hiện tại δH 3,15(1H, dd, J = 3,5, 11,5 Hz, H-3)

khẳng định chocấu hình α thường gặp của H-3, điều này đượckhẳng định bằng tương tác khơng gian nhậnđược trên phổ ROESY (Hình 3.6) của H-5 (δH 0,86) với H-3 (δH 3,15) và H-31 (δH 1,21). Tương tácROESY của H-17 (δH 2,79) với H-21 (δH 1,37) và H-32 (δH 0,87) cho phép khẳng định H-17,H-21 và H-32 đều có cấu

Hình 3.6: Phổ ROESY của chất 1

Từ tất cả cácdữ kiện đã nêu, hợp chất 1 được khẳng địnhchính là colochiroside A, một triterpene saponinđã được cơng bố từ lồi hải sâm C. anceps[21] và có cấu trúc hóa học như hình 3.7.

Hình 3.7: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 – hợp chất colochiroside A Hợp chất 2 cũngđược phân lập từ loài hải sâm Cercodemas anceps dưới Hợp chất 2 cũngđược phân lập từ loài hải sâm Cercodemas anceps dưới

dạngchất bột màu trắng.Các phổ NMR của nó cũngđặc trưng cho một hợp chất triterpenesaponin. Sự xuất hiện 04 tín hiệu cacbon anome tại δC 105,31 (H-1′),

hiệuproton anome tươngứng tại δH 4,74 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 5,13 (1H, d, J = 7,5Hz, H-1′′), 4,86 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1′′′) và 5,31 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′′′)

chứng minh sự có mặt của 04 gốcđường (Bảng 3.1 và 3.2).

Hình 3.8: Phổ 13C-NMR của chất 2

Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất 2

Tuy nhiên, không giống nhưở hợp chất 1, phần aglycon của hợp chất 2đãmấtđitínhiệu của nhóm keton C-16 và thay vàođó là sự xuất hiện các tín hiệu

vàmộtnhómaxetoxyl [δC 169,83 (CO) và 21,10 (CH3)/ δH 2,01 (3H, s, CH3)]. Vị tríliênkếtcủanhóm Oacđược xácđịnh tại C-16 trên cơ sở tương tác xa HMBC(hình 3.10) nhậnđượcgiữaH-16 (δH 5,97) và nhóm carbonyl OAc (δC 169,83).

Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR (125 MHz, Pyridine-d5) phần chuỗi đƣờng của các hợp chất 1, 2 và các chất tham khảo

C aδC 1 bδC 2 δC δH (J = Hz) δC δH (J = Hz) Sulfo-Xyl 1 104,9 104,85 4,72 d (7,0) 105,3 105,31 4,74 d (7,5) 2 82,4 81,33 4,00* 83,8 83,30 4,08* 3 74,9 75,61 4,35 t (9,0) 76,4 75,77 4,33* 4 75,3 76,08 5,05* 75,3 76,29 5,13* 5 64,6 64,38 3,85*/4,80 dd (5,0, 12,0) 64,5 64,47 3,80/4,86* Qui 1 102,7 102,03 5,30 d (7,5) 105,6 105,51 5,13 d (7,5) 2 84,3 82,84 3,96* 75,6 76,54 4,03* 3 73,9 75,17 4,02* 75,8 75,43 4,10* 4 88,0 86,65 3,45 t (9,0) 86,1 85,93 3,68* 5 70,8 70,75 3,58 dd (6,0, 9,0) 71,9 71,75 3,77* 6 18,1 16,65 1,58 d (6,0) 18,0 18,05 1,74 d (6,5) Sulfo-Glc Xyl 1 104,9 104,26 4,75 d (7,0) 105,3 105,13 4,86 d (7,0) 2 74,9 73,54 3,82* 73,9 73,52 4,00* 3 87,48 86,46 4,15 t (9,0) 87,2 87,42 4,16* 4 70,06 69,24 3,90* 69,0 69,12 4,04* 5 75,6 75,37 4,07* 66,7 66,54 3,64/4,21 6 67,98 67,10 4,70 dd (6,5, 11,0)/5,02* MeGlc 1 105,8 105,00 5,23 d (7,5) 105,7 105,43 5,31 d (8,0) 2 70,3 74,80 3,88* 75,2 75,12 4,00* 3 87,9 87,54 3,65 t (9,0) 88,1 88,02 3,73* 4 70,6 70,34 402* 70,7 70,65 4,13* 5 78,3 78,03 3,88* 78,3 78,32 3,96* 6 64,6 61,83 4,15*/4,40 br d (12,0) 62,1 62,22 4,26/4,48* OMe 60,6 60,61 3,80 s 60,61 60,79 3,87 s Xyl 1 106,2 105,64 5,22 d (7,0) 2 75,3 75,09 3,94* 3 77,2 76,65 4,06 t (9,0) 4 74,3 70,34 4,02* 5 67,6 66,70 3,65 t (11,0)/4,28 dd (4,5, 11,0)

Hình 3.10: Phổ HMBC của chất 2

Hình 3.12: Phổ COSY của chất 2

Hình 3.13: Phổ ROESY của chất 2

Bằng cách so sánh số liệu phổ 13C-NMR (bảng 3.1, 3.2) củachất 2 với các số liệu đã được công bốkết hợp với phân tích phổ cộng hưởng từ hạtnhân hai

chiềuHSQC, HMBC, COSY và ROESY, hợp chất 2 được xác định là philinopside A[18]và có cấu trúc hóa học như hình 3.14. Hợp chất này đã được cơng bốtừ lồi hải sâm Pentacta quadrangularis[18].

Hình 3.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 – hợp chất philinopside A

Trên thế giới, chất colochiroside A từng được phân lập bởi nhóm tác giả ZHANG Yong-juan năm 2011 [19] và chấtphilinopside A được phân lập từ loài

Pentacta quadrangularis[18] nhưng đây là lần đầu tiên phân lập được từ loài Cercodemas anceps. Các nhóm tác giả đều sử dụng kết hợp sắc ký và khối phổ để

phân tích cấu trúc hợp chất.Thơng thường, các kết quả từ các kỹ thuật này đều rất lớn và phức tạp.Nhiều hợp chất đã được công bố sẽ giúp so sánh kết quả, dự đốn cấu trúc một cách nhanh và chính xác hơn.Ngược lại, nếu phân lập được hợp chất mới có thể mất rất nhiều thời gian để phân tích cấu trúc. Cần kết hợp các kỹ thuật như khối phổ hay các phản ứng, tính chất hóa học của chất phân lập để xác định các nhóm cấu trúc. Vì vậy, việc nắm bắt và tìm hiểu cấu trúc, tính chất hóa học các hợp chất đã được cơng bố là rất cần thiết.

Kết quả thu được các hợp chất này từ loài hải sâm Cercodemas anceps cũng cho thấy tiềm năng rất lớn từ các loài hải sâm ở Việt Nam. Với sự phong phú và đa dạng cấu trúc của saponin, việc tìm ra chất saponin mới từ Việt Nam hồn tồn có thể xảy ra. Hai hợp chất phân lập được được sử dụng cho các thí nghiệm thử độc tính tế bào tiếp theo và được phối hợp trong các chế phẩm sinh học trong đề tài.