Hai chất mới phân lập đều cho thấy tính độc đối với dòng tế bào ung thư MCF7 và Sarcoma 180, bước đầu khẳng định tính kháng tế bào ung thư như mục đích đánh giá của đề tài. Chế phẩm sinh học được tách chiết theo dự án khoa học và công nghệ trọng điểm về tiềm năng dược liệu da gai ở vùng biển Đông Bắc Việt Nam sẽ được sử dụng để làm đối tượng đánh giá tiếp theo dựa trên mô hình đơn lớp trên chính hai dịng tế bào MCF7, Sarcoma-180 và mơ hình chuột thí nghiệm. Đây là mục tiêu mở rộng của đề tài và thu được kết quả như sau:
Độc tính của CPSH trên MCF7 và Sarcoma-180
Thí nghiệm được tiến hành với bố trí thí nghiệm và nồng độ như đã nêu.Chế phẩm đã thể hiện hoạt tính gây độc đối với cả hai dịng tế bào trong thí nghiệm và mức độ cũng khá giống nhau.Tại nồng độ thứ ba là 6 µg/ml, CPSH gây ức chế cả hai dòng tế bào ở mức xấp xỉ 50%. Dựa trên đường cong đáp ứng liều và phương trình tuyến tính, chỉ số IC50 xác định là 5,26 µg/ml đối với dịng tế bào Sarcoma-180
và 6,47 µg/ml đối với dịng MCF7. Chỉ số tương quan R2 tương ứng là 0,957 và 0,994.
Đối với dòng MCF7, chế phẩm gây độc mạnh hơn so với cả hai chất mới phân lập. Tuy nhiên, sự chênh lệch là khơng nhiều khi IC50 của CPSH đối với dịng tế bào này chỉ thấp hơn 0,5 µg/ml so với chất 1 và 1,46 µg/ml so với chất 2 khi thử riêng. Đối với dịng Sarcoma-180, chế phẩm thể hiện hoạt tính mạnh hơn rất nhiều. Chỉ số IC50 nhỏ hơn so với chất 1 và chất 2 lần lượt là 6,12 µg/ml và 23,73 µg/ml.
Hình 3.18: Đƣờng cong đáp ứng liều của Sar.180 (A) và MCF7 (B) đối với CPSH
Xác định tác dụng gây chết theo chương trình của CPSH:
Chết theo chương trình là cơ chế chết tự nhiên, an tồn cho mơ và cơ thể nên các các chất và chế phẩm sinh học có cơ chế gây chết này được đánh giá rất cao trong tác dụng của thuốc chống ung thư. Để chứng minh thêm cơ chế gây độc trên tế bào ung thư và kiểm tra mức độ biểu hiện gây chết tế bào ung thư theo chương trình của chế phẩm sinh học, thí nghiệm đã được tiến hành với hai dòng tế bào là MCF7 và Sarcoma 180, ba nồng độ là 10, 20 và 40 µg/ml trong 24 giờ ủ chế phẩm.
Hình 3.19: Mẫu ĐC TB Sar.180 với Annecxin V
Đối chứng không nhuộm (A) và Đối chứng có nhuộm (B), kháng thể Annexin V cho tín hiê ̣u màu xanh lá (FITC)
Hình 3.20: Mẫu ĐC TB Sar.180 với PI
Đối chứng không nhuộm (A) và Đối chứng có nhuộm (B), nhuộm nhân Propidium Idide cho tín hiê ̣u màu đỏ (PI)
Hình 3.21: Mẫu ĐC TB MCF7 với Annecxin V
Đối chứng không nhuộm (A) và Đối chứng có nhuộm (B), kháng thể Annexin V cho tín hiê ̣u màu xanh lá (FITC)
A
A
B
B
Hình 3.22: Mẫu ĐC TB MCF7 với PI
Đối chứng không nhuộm (A) và Đối chứng có nhuộm (B), nhuộm nhân Propidium Idide cho tín hiê ̣u màu đỏ (PI)
Sau thời gian 24h ủ với CPSH, tế bào được nhuô ̣m với kháng thể đă ̣c hiê ̣u apoptosis là Annecxin V cho tín hiệu màu xanh lá và thuốc nhuộm nhân PI (Propidium Iodide) cho tín hiệu màu đỏ.Tín hiệu xanh của Annecxin V biểu hiện tế bào đang chết theo chương trình trong giai đoạn sớm, tín hiệu đỏ của PI cho biết những tế bào có màng sinh chất khơng cịn tồn vẹn, đang trong q trình muộn của chết theo chương trình.
Đối với đối chứng khơng thử thuốc, tế bào có nhuô ̣m và không nhuô ̣m kháng thể ở cả hai dòng tế bào , đều cho cùng một kết quả là khơng có biểu hiện tín hiệu Annexin V trên màng cũng như tín hiê ̣u nhân PI khi nhuô ̣m nhân dưới b ước sóng kích thích. Các hình 3.19 – 3.22 là ảnh chụp tại một vài vi trường của quần thể tế bào. Một vài vi trường có nhận những điểm bắt màu thuốc nhuộm là do có tế bào chết trong quần thể đối chứng nhưng số lượng ghi nhận không đáng kể nên kết quả này là cơ sở để so sánh với các mẫu tế bào thử thuốc .
Tế bào Sarcoma 180 sau 24 giờ ủ với CPSH ở nồng độ 10, 20, 40µg/ml đều đã cho thấy tín hiệu quần thể có tế bào chết theo chương trình (những tế bào bắt màu xanh của thuốc nhuộm Annexin V). Trong đó, nồng độ 10µg/ml ghi nhận tín hiệu ít và yếu nhất, nồng độ 40µg/ml ghi nhận rất nhiều tín hiệu tế bào bắt màu xanh lá với cường độ lớn hơn hẳn so với hai nồng độ cịn lại (Hình 3.23). Tín hiệu màu đỏ (nhuộm nhân PI) xuất hiện rõ ở nồng độ 40µg/ml chứng tỏ những tế bào chết theo chương trình ở nồng độ này đang chết ở giai đoạn muộn của apoptosis.
Hình 3.23: Tế bào Sar.180 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH
(A) 10µg/ml, (B) 20 và (C) 40µg/ml, sau 24h, màu xanh lá
Hình 3.24: Tế bào Sar.180 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH
10µg (A), 20µg(B) và 40µg(C), sau 24h, màu đỏ
Một vài tế bào bắt màu đỏ rõ ràng ở nồng độ 20µg/ml và tín hiệu đỏ khá yếu ở nồng độ 10µg/ml. Như vậy, ngay ở nồng độ thấp nhất 10 µg/ml CPSH đã cho thấy khả năng gây chết theo chương trình, quan sát được ở giai đoạn sớm đối với mốc thời gian 24 giờ trong thí nghiệm này.
A
A B
C B
Hình 3.25: Tế bào MCF7 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH
(A) 10µg/ml, (B) 20µg/ml và (C) 40µg/ml, sau 24h, màu xanh lá
Hình 3.26: Tế bào MCF7 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH
10µg/ml (A), 20µg/ml (B) và 40µg/ml (C), sau 24h, màu đỏ
Đối với dòng tế bào MCF7, nồng độ CPSH ở 40 µg/ml đã gây chết tế bào mạnh khiến cho tế bào bong khỏi bề mặt nuôi cấy gần 90% nên số lượng tế bào cịn lại rất ít và không phản ánh đúng trạng thái quần thể. Ở nồng độ 20µg/ml, MCF7 cũng chịu tác động mạnh nên tỷ lệ chết và bong khỏi bề mặt nuôi cấy khá lớn, nhưng những thế bào cố định được trên bề mặt ni cấy cho thấy tín hiệu chết theo chương trình khá rõ (Hình 3.25B). Kết hợp với hình ảnh của MCF7 ủ 20µg/ml, nhuộm nhân PI (Hình 3.26B) cho thấy màu đỏ khơng cịn chỉ tập trung ở vùng nhân mà còn rộng ra hầu khắp tế bào, chứng tỏ quần thể tế bào đang chết theo chương trình ở giai đoạn muộn hoặc có cả tế bào chết hoại tử (neucrosis) do tác động mạnh của chế phẩm ở nồng độ 20µg/ml.
Ở nồng độ 10 µg/ml, tế bào vẫn giữ được tính chất quần thể. Các tế bào chết theo chương trình biểu hiện khá rõ với tín hiệu màu xanh lá (Hình 3.25). Kết hợp với hình ảnh nhuộm nhân PI (Hình 3.26) cho thấy nhiều trường hợp tế bào chết khác nhau: Tế bào chết theo chương trình ở giai đoạn sớmvới biểu hiện bắt màu
A C B A C B a a b b c c
xanh lá của Annecxin V mà không bắt màu đỏ PI (mũi tên a), tế bào chết theo chương trình ở giai đoạn muộn với biểu hiện bắt màu xanh lá và bắt màu đỏ (mũi tên b) và cả tế bào không bắt màu xanh lá của Annecxin V nhưng bắt màu đỏ của PI cho thấy có thể tế bào đang chết khơng theo apoptosis. Như vậy, chế phẩm có tác dụng gây chết theo chương trình đối với MCF7 ngay ở nồng độ 10µg/ml nhưng tín hiệu Annecxin V trong thí nghiệm này khơng đại điện cho quần thể apoptosis giai đoạn sớm. Thời điểm đánh giá 24 giờ là muộn so với sự tác động của chế phẩm đối với dòng MCF7.
Kết quả gây u thực nghiệm cho chuột thí nghiệm
Sau khi nuôi cấy in vitro các tế bào nghiên cứu , thu lươ ̣ng tế bào đủ cho viê ̣c cấy ghép trên cơ thể chuô ̣t với tỉ lê ̣ 1,5x106 tế bào/conx30con. Trong thí nghiệm này chúng tơi cũng thực hiê ̣n c ấy ghép tế bào dưới da ở vùng ngực (lệch về phía bên trái).Kết quả gây u thực nghiệm thể hiện qua hình 3.27.
Hình 3.27: U thực nghiệm dƣới da của một số chuột thí nghiệm
Qua hình ảnh thu được cho thấy khả năng tạo u rắn trên chuột của dòng tế bào Sar.180 là khá tốt và ổn định, đạt tỷ lệ 100% cá thể chuột lên u, khối u có thể quan sát rõ.
Kết quả ảnh hưởng của chế phẩm lên sự tăng trọng của chuột
Trong quá trình thử nghiệm, để tìm hiểu tác động của chế phẩm đến sự tăng trọng lượng của chuột thí nghiệm, tiến hành theo dõi trọng lượng chuột sau mỗi
1 6 5 4 3 2
ngày và ghi lại trọng lượng sau mỗi 3 ngày ở mỗi lô, sau đó sử dụng chương trình Microsoft Office 2010 tính trọng lượng trung bình, sai số của từng lơ. Đồng thời, chúng tôi cũng tiến hành theo dõi các biểu hiện về hoạt động, ăn, uống, vận động cơ học của chúng. Kết quả 9 lần cân được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.3: Tổng hợp trọng lƣợng trung bình của chuột ở các lơ thí nghiệm Lần cân Lần cân
Lô
Lần cân
Ngày 1 Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Ngày 15 Ngày 18 Ngày 21 Ngày 24
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Lần 7 Lần 8 Lần 9
ĐCSH 20.2±1.3 23±0.9 26.4±1.0 34.2±1.1 38±2.4 43±1.6 46±2.7 47.4±2.1 49±4
ĐCUT 20.3±1.3 22.9±1.5 26.3±1.5 32.9±1.8 35.1±2.6 40.1±2.5 41±3.1 43.2±3.1 44.1±4.4
UT+6MP 20.4±1.1 23±1.2 25.9±1.2 28.3±1.6 31.6±3.3 29.6±2.05 30.9±2.1 33.3±2.7 33.3±3.6
UT+CPSH 20.2±1.4 23.3±1.8 27.1±1.8 29.3±1.7 32.1±3.03 35.9±2.9 37.5±5.1 39.7±3.2 39.5±2.8
Hình 3.28: Đồ thị biểu diễn sự tăng trọng lƣợng các lơ ung thƣ trong q trình thí nghiệm
Về hình thái chung , chuột mang u rắn được thử nghiệm với chế phẩm cũng như các lơ như ĐCSH và ĐCUT đều có th ể trạng tốt khơng có hiện tượng bỏ ăn , tính chất phân khơng bất thường , lông không sù, chậm chạp hay một số biểu hiện đặc biệt như run rẩy, co giật. Trọng lượng cơ thể chuột ở các lô đối chứng tăng đều, phản ánh tình trạng sức khỏe đạt yêu cầu để làm đối chứng. Ở lô UT+6MP có các biểu hiê ̣n sau thử nghiê ̣m ở lần 7 (ngày thứ 14 sau cấy ghép ) như chuô ̣t bắt đầu ăn uống ít, lơng xù, sút cân, ít hoạt động và càng các lần thử sau càng thể hiện rõ . Hiện
Trọng lƣợng chuột trong q trình thí nghiệm
Lần cân P
(g)
tượng này có thể là do tác dụng phụ của thuốc 6MP ảnh hưởng đến cơ thể chuột. Qua đó, có thể thấy rằng chế phẩm khơng có tác động gây độc, an toàn cho chuột mang u rắn khi được thử nghiệm với liều như trên.
Kết quả kháng u rắn Sarcoma 180 dưới da của chế phẩm
30 chuột được cấy ghép u với tế bào ung thư Sarcoma 180 được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con là ĐCUT, UT+CPSH, UT+6MP.Kết quả quan sát khối u tính đến
ngày thứ 32 sau cấy ghép u và cũng là ngày kết thúc đợt thử nghiệm bằng CPSH,
kích thước khối u ở lơ chuột được thử nghiệm với thuốc 6MP (chứng dương) là nhỏ nhất và đã tiêu biến rất đáng kể so với ban đầu (Hình 3.29). Kích thước khối u ở lơ ĐCUT khơng thử nghiệm thuốc có thích thước lớn nhất và tại thời điểm này hầu hết khối u ở lô này đều to và có xuất hiê ̣n lõi hoa ̣i tử rõ ràng . Đối với lô UT+CPSH, chỉ 1/3 số khối u xuất hiện lõi hoại tử. Như vậy, cho đến ngày 32, kích thước khối u của lơ UT+CPSH nhỏ hơn lô ĐCUT và lớn hơn lô đối chứng dương UT+6MP. Sự chênh lệch về kích thước khối trong suốt q trình thí nghiệm được thể hiện rõ qua bảng 3.4.
Hình 3.29: Hình ảnh khối u ở chuột tại các lơ thí nghiệm vào ngày thứ 32 sau cấy u
Trong quá trình thử nghiệm đo kích thước khối u (cm3) và đư ợc xác định theo công thức (1) từ ngày thứ 7 sau cấy ghép u và là ngày b ắt đầu thử nghiệm
ĐCUT UT+CPSH UT+6MP 2.90cm3 0.44cm 3 1.37cm3
CPSH. Từ kết quả đo, xác định đươ ̣c kích thư ớc trung bình của khối u của từng lơ chuột thí nghiệm.
Bảng 3.4: Theo dõi kích thƣớc khối u trong q trình thử nghiệm Ngày Lô Ngày 5 (lần 1) Ngày 8 (lần 2) Ngày 11 (lần 3) Ngày 13 (lần 4) Ngày 16 (lần 5) Ngày 19 (lần 6) Ngày 21 (lần 7) Ngày 23 (lần 8) Ngày 26 (lần 9) ĐCUT 0.05±0.02 0.25±0.08 0.55±0.2 1.04±0.3 1.43±0.3 2.37±0.3 2.57±1.0 2.69±1.1 2.91±1.2 UT+6MP 0.05±0.02 0.19±0.1 0.26±0.2 0.28±0.2 0.39±0.2 0.38±0.2 0.39±0.2 0.46±0.2 0.44±0.2 UT+CPSH 0.06±0.01 0.17±0.1 0.37±0.2 0.62±0.4 0.92±0.4 1.22±0.9 1.276±0.6 1.29±0.7 1.37±0.9
Qua bảng 3.4 và hình 3.30, kích thước khối u cấy ghép dưới da ở lô chuột đối chứng ung thư tăng đều qua mỗi lần đo do không được điều trị với thuốc. Đến lần đo thứ 9 (cuối cùng), kích thước khối u đã tăng trung bình khoảng 58,2 lần (từ 0,05 đến 29,1 cm3). Kích thước khối u của lơ UT+6MP, do được điều trị với thuốc đối chứng 6MP nên kích thước khối u tăng rất chậm so với hai lơ cịn lại. Sau 26 ngày, kích thước khối u chỉ tăng 8,8 lần (từ 0,05 đến 0,44 cm3), thậm chí cịn giảm nhẹ trong những ngày điều trị cuối. Điều này một lần nữa khẳng định sự hiệu quả trong điều trị kháng u của 6MP và lựa chọn 6MP làm đối chứng dương là chính xác.
Hình 3.30: Đồ thị tăng trƣởng kích thƣớc trung bình của u rắn ở các lơ thí nghiệm
Đồ thị hình 3.28 cho thấy CPSH có khả năng kháng u khá tốt. Kích thước
3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kích t h ước ( V m 3) Lần đo Kích thƣớc u ở các lơ thí nghiệm ĐCUT UT+6MP UT+CPSH
CPSH đã kìm hãm sự phát triển của khối u xấp xỉ 53%, và hiệu quả kháng u bằng 38,6% thuốc 6MP.
Dựa trên những kết quả này chúng tôi đánh giá được mức độ phát triển khối u dưới tác dụng của chế phẩm. Khả năng ức chế và sự phát triển khối u của CPSH thông qua tỷ số ức chế IR% và tỷ số phát triển GR%. Từ hai tỷ số này dựa vào thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa (Bảng 2.9) để xác định được hiệu lực kháng. Kết quả thu được của các chỉ tiêu nghiên cứu được tổng hợp ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Tổng hợp kết quả khảo sát tác dụng kháng u của CPSH trên chuột mang u rắn Sar.180
TT Các chỉ tiêu theo dõi ĐCUT UT+CPSH UT+6MP
1 Số lượng chuột thí nghiệm 10 10 10
2 Số lượng chuột khi kết thúc thí nghiệm 10 10 8
3 Tỷ lệ tạo u (%) 100 100 100
4 Tỷ lệ không tạo u (%) 0 0 0
5 Kính thước trung bình u(mm) 2.900 1,370 0.440
6 GR (theo Kích thước trung bình u) 100 47.35 15.26
7 IR (theo Kích thước trung bình u) 0 52.65 84.74
8 Hiệu lực kháng u (theo Itokawa) 0 + ++
Như vậy, dựa vào thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa, kết quả thu được về hiệu quả kháng u như sau:
- Đối với CPSH (UT+CPSH) tỷ số ức chế IR% tương ứng là 52.65%, đạt hiệu lực kháng u (+).
- Đối với thuốc chứng dương 6MP tỷ số này là 84.74%, đạt hiệu lực kháng u (++).
Kết quả ảnh hưởng của chế phẩm lên một số chỉ số huyết học máu ngoại vi của chuột trong nghiên cứu
Các lơ thí nghiệm sau thử nghiệm thuốc và CPSH bằng cách đưa thuốc qua thực quản (per.os), cùng 2 lô đối chứng: đối chứng sinh học và đối chứng ung thư sau đợt thử nghiệm các cá thể chuô ̣t đư ợc mổ, lấy máu ngoại vi đem phân tích 20 thơng số bằng máy phân tích sinh hóa máu tự động Swelab Alpha , Thụy Điển t ại Học viện Quân Y 103. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.6.
Bảng 3.6: Các chỉ số huyết học của chuột ở các lơ thí nghiệm và đối chứng
STT Chỉ số huyết học ĐCSH ĐCUT UT+6MP UT+CPSH
1 Bạch cầu(3,0-14,2) 5.40 11.72 3.10 22.83
2 Hồng cầu (5,0-9,5) 7.77 7.58 2.18 7.40
3 Hemoglobin 12.58 12.16 3.80 12.16
4 Hồng cầu trong máu (%) 38.46 37.24 10.62 36.60
5 Thể tích khối tiểu cầu 0.40 0.35 0.66 0.39
6 Tế bào Lympho (3,22-11,2) 4.70 9.16 2.90 8.28
7 Bạch cầu hạt 0.14 0.54 0.05 1.03
Qua bảng số liệu (Bảng 3.6) có thể thấy các chỉ số huyết học như hồng cầu, lượng bạch cầu các loại của lơ ĐCSH đều nằm trong mức bình thường [6]. Chuột ở lơ ĐCUT có nhiều chỉ số tăng so với ĐCSH nhưng vẫn nằm trong giới hạn sinh lý bình thườngchứng tỏ sự ổn định trong tình trạng sức khỏe của chuột thí nghiệm.
Chuột ở các lơ thử nghiệm thuốc đều có nhiều thay đổi về chỉ số huyết học. Lơ UT+6MP có thay đổi ở cả hồng cầu, tiểu cầu và các loại bạch cầu và chúng có