Bƣớc chính Chi tiết Ghi chú
Chuẩn bị tế bào
- Chuẩn bị đĩa 96 giếng và tế bào khoẻ mạnh
- Thu tế bào bằng Trypsin-EDTA 1x
- Sử dụng pipet đa kênh để nhả vào mỗi giếng nồng độ: 5000 tế bào/ 180 µl mơi trường/ giếng.
- Đảm bảo mật độ đều giữa các giếng
Pha thuốc và thử thuốc
- Pha dung dịch thuốc trung gian và ĐCDM với nồng độ gấp 10 lần nồng độ cuối cùng thử ở các giếng.
- Nồng độ DMSO cuối là 0,5 %
- Bổ sung 20 µl thuốc tương ứng lên các giếng ghi nhãn tương ứng
- Hồ đều vào mơi trường
- Đặt trong tủ 37°C, 5% CO2, theo dõi trong 48h
Ủ MTS
- Chuẩn bị dung dịch MTS/PMS với tỷ lệ 1PMS:20MTS
- Tránh ánh sáng
- Thêm 30 µl hỗn hợp trên vào mỗi giếng, ủ trong 3 giờ với điều kiện 37°C, 5% CO2
- Tránh ánh sáng
Đo OD - Sử dụng máy Microplate Reader Model
680 để đo kết quả OD của từng giếng
Xử lý số liệu:
Sử dụng phần mềm Excel để xử lý số liệu, tính chỉ số IC50. Chỉ số này là giá trị nồng độ chất thử, tại đó, chất thử có khả năng gây chết 50% tế bào.
Chỉ số IC50 của một chất được tính từ nghiệm phương trình hồi quy biểu diễn tương quan giữa x là nồng độ (hoặc logarit nồng độ) chất thử đó và y là chỉ số tăng sinh A(%) của dịng tế bào được thử, khi y = 50% (Hình 15).
A (%) được tính theo cơng thức:
Trong đó: V: Chỉ số OD trung bình ở các giếng thử thuốc Vh: Chỉ số OD trung bình ở các giếng ĐCDM
Hình 2.9: Xác định chỉ số IC50[25]
2.3.4. Phƣơng pháp xác định tế bào apoptosis dƣới tác dụng của CPSH
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang để xác định các tế bào chết theo chương trình. Phương pháp phụ thuộc vào sự xuất hiện của phosphatidylserin (PS) và các ion canxi trên màng của những tế bào có dấu hiệu chết theo chương trình sớm. Kháng thể Annexin V kết hợp với thuốc nhuộm có phát huỳnh quang Alexa Four488/PI sẽ gắn vào PS trên bề mặt những tế bào này(Hình 16). Dưới bước sóng kích thích, những tế bào nào được ghi nhận tín hiệu huỳnh quang chính là những tế bào đang chết theo chương trình.
Quy trình tiến hành: