2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.4. Phƣơng pháp xácđịnh tế bào apoptosis dƣới tác dụng của
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang để xác định các tế bào chết theo chương trình. Phương pháp phụ thuộc vào sự xuất hiện của phosphatidylserin (PS) và các ion canxi trên màng của những tế bào có dấu hiệu chết theo chương trình sớm. Kháng thể Annexin V kết hợp với thuốc nhuộm có phát huỳnh quang Alexa Four488/PI sẽ gắn vào PS trên bề mặt những tế bào này(Hình 16). Dưới bước sóng kích thích, những tế bào nào được ghi nhận tín hiệu huỳnh quang chính là những tế bào đang chết theo chương trình.
Quy trình tiến hành:
Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định tế bào chết theo chƣơng trình
Tế bào Sarcoma 180 Tế bào ung thƣ vú MCF7
ĐCSH 24h CPSH (10µg/ml) 24h CPSH (20µg/ml) 24h CPSH (40µg/ml) 24h CPSH (10µg/ml) 24h CPSH (20µg/ml) 24h CPSH (40µg/ml) 24h ĐCSH 24h
Bảng 2.7: Quy trình tiến hành thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang
Bƣớc chính Chi tiết Ghi chú
Hoạt hố và ni tế bào
- Rã đông tế bào từ -196°C trong bể ổn nhiệt 37°C.
- Nhanh chóng rã đơng trong 1 phút
- Ly tâm 1000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch nổi.
- Hồ đều tế bào vào mơi trường mới, cho vào đĩa nuôi cấy đặt trong tủ 37°C, 5% CO2
- Tách tế bào thành dạng đơn lẻ
- Thay môi trường thường xuyên 2-3 ngày/ lần
- Cấy chuyển tế bào khi mật độ tế bào đạt 70 – 90% bề mặt nuôi cấy bằng Trypsin - EDTA 1x trong 5 phút, 37°C.
- Chuyển sang chai nuôi cấy mới
Chuẩn bị coverslip (chỉ đối với dịng tế bào bám dính)
- Chuẩn bị coverslip, đĩa 24 giếng
- Đặt các coverslip vào mỗi giếng, rửa bằng PBS 1x, để khô dưới tia UV 1 giờ
Chuẩn bị tế bào
- Đảm bảo tế bào khoẻ mạnh, không nhiễm - Thu tế bào bằng Trypsin – EDTA 1x
- Nhả tế bào vào trong mỗi giếng với mật độ 120 000 tế bào/ 450 µl mơi trường/ giếng
- Đảm bảo mật độ đều giữa các giếng
- Đặt vào tủ 37°C, 5% CO2, nuôi ổn định
Pha thuốc và thử thuốc
nồng độ gấp 10 lần nồng độ cuối cùng thử ở các giếng
- Bổ sung 50 µl thuốc tương ứng lên các giếng ghi nhãn tương ứng
- Hồ đều vào mơi trường
- Đặt trong tủ 37°C, 5% CO2, theo dõi trong 24 giờ Cố định tế bàođối với dịng TB bám dính - Rửa bằng PBS 1X, cố định bằng PFA 4% - Rửa bằng PBS 1X, tạo tính thấm bằng Triton X
0,5%
- Rửa bằng PBS 1X, tăng tính đặc hiệu bằng BSA 5%
Cố định tế bào đối với dịng TB trơi nổi
- Ly tâm 1000rpm, 5’ để thu tế bào, Rửa bằng PBS 1X
- Ly tâm 1000rpm, 5’, cố định bằng PFA 4%
- Ly tâm 1000rpm, 5’, rửa bằng PBS 1X
- Ly tâm 1000rpm, 5’, tạo tính thấm bằng Triton X 0,5%
- Ly tâm 1000rpm, 5’, rửa bằng PBS 1X - Ly tâm 1000rpm, 5’, tăng tính đặc hiệu bằng
BSA 5% Nhuộm kháng thể đối với dịng tế bào bám dính
- Rửa bằng PBS 1X, Rửa với đệm gắn của Annexin V (binding buffer)
- Ủ tế bào với Annexin V (20%) - Tránh ánh sáng - Rửa bằng PBS 1X, nhuộm nhân tế bào bằng PI - Tránh ánh sáng
Nhuộm kháng thể đối với dịng tế bào trơi
- Ly tâm 1000rpm, 5’, rửa bằng PBS 1X - Ly tâm 1000rpm. 5’, rửa bằng đệm gắn của
Annecxin V (binding buffer)
nổi (20%)
- Ly tâm 1000rpm, 5’, rửa bằng PBS 1X - Ly tâm 1000rpm, 5’, nhuộm nhân bằng PI
- Tránh ánh sáng
Gắn
coverslip với TB bám dính
- Rửa bằng PBS 1X, gắn coverslip lên lam kính bằng Glycerol và sơn gắn lamelle
- Tránh ánh sáng
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang