Mẫu hải sâm tươiđược tiến hành bỏ nội tạng (1,5 kg), cắt nhỏ và ngâm chiếtbằng metanol (3 lần). Dịch chiết thuđượcđược tiến hành lọc, cất loại dung môi dướiáp suất giảm thuđược cặn chiết metanol (M, 29,5 g). Cặn nàyđược hòa vào nước cất(1,0 lít) và chiết phân lớp lỏng/lỏng với dung mơi CH2Cl2 (3×1,0 lít).
Lớp nước (W) được tiến hành phân táchtrên cột sắc ký nhồi Diaion HP-20 rửa giảităng dần nồng độ metanol trong nước (0,25, 50, 75 và 100%) thu được bốn phânđoạn W1–W4, sau khi loại bỏ phần rửa giảibằng nước. Phân đoạn W4 (0,5 g) được tiếnhành phân tách trên hệ thống sắc ký lỏngtrung áp (MPLC) với cột nhồi silica gel vàsử dụng pha động CH2Cl2–MeOH–H2O(4:1:0,1, v/v) thu được 4 phân đoạn nhỏ,W4A-W4D. Tinh chế phân đoạn W4C (150mg) bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 rửa giải bằng hệ dung môi MeOH–H2O(1:1,5, v/v) thu được hợp chất 1 (3,5 mg)dưới dạng chất bột màu trắng.
Cặn CH2Cl2 (C, 11,2 g) được phân táchthành bảy phân đoạn C1–C7, sử dụng MPLCvới cột nhồi silica gel và pha động là CH2Cl2–MeOH (100:1-1:1, v/v). Phân đoạn C-6 (1,2g) và C-7 (0,8 g) được gộp lại và phân táchtrên sắc ký cột silica gel pha thường rửa giảibằng CH2Cl2–MeOH–H2O (4:1:0,1, v/v) thuđược năm phân đoạn nhỏ, C6A–C6E. Hợpchất 2 (3,0 mg) được tinh chế từ phân đoạnnhỏ C6B (0,35 g) bằng sắc ký cột silica gelpha thường sử dụng hệ dung môi rửa giảiCH2Cl2– MeOH–H2O (5:1:0,1, v/v).
Chất 1: Chất bột màu trắng;[α]D -13 (c 0,1, MeOH); 1H-NMR (500
MHz,Pyridine-d5) và 13C-NMR (125 MHz,Pyridine-d5).
Chất 2: Chất bột màu trắng;[α]D -19 (c 0,1, MeOH); 1H-NMR (500
MHz,Pyridine-d5) và 13C-NMR (125 MHz, Pyridine-d5).
Hai chất đã được phân lập từ hải sâm khi tiến hành phối hợp nhiều bước sắc ký khác nhau đem lại hiệu quả khá cao.Hiện nay, phương pháp này được coi là phương pháp thông thường, được sử dụng phổ biến để phân tách các hợp chất saponin vì các hợp chất saponin có cấu trúc rất phức tạp nên khó có thể sử dụng chỉ một kỹ thuật đơn lẻ để tách trực tiếp saponin.Gần đây, các nhà nghiên cứu đã chứng minh khi kết hợp HSCC (high speed counter-current) và ELSD (evaporative light scattering detector) giúp cho khả năng phân tách saponin đạt hiệu quả cao. Và giải
quyết được vấn đề khi có nhiều saponin khơng có nhóm mang màu, khiến cho việc thu tín hiệu UV khơng đặc hiệu [14].