1.5.1. Mơ hình ni cấy đơn lớp tế bào
Mơ hình ni cấy đơn lớp sử dụng giá thể ni cấy là những chai, đĩa có bề mặt phẳng với những kích thước khác nhau.Tế bào nuôi cấy là một dòng tế bào phân lập được hoặc dòng tế bào thương mại tại các ngân hàng tế bào. Trong mơ hình này, tế bào được ni có thể ở hai dạng: bám dính hoặc trơi nổi. Một số dịng tế bào ung thư như tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, tế bào ung thư vú MCF7 sống ở dạng bám dính nên thường có dạng hình sao do phát triển nhiều điểm bám dính để bám trên bề mặt nuôi cấy. Các tế bào này xếp thành một lớp đơn trên các dụng cụ nuôi cấy nên dụng cụ nuôi cấy thường phải được xử lý bề mặt để đảm bảo khả năng bám được trên bề mặt của các tế bào dạng này.Các dụng cụ không được xử lý bề mặt hoặc xử lý bề mặt kém sẽ làm chậm khả năng phát triển của cả quần thể tế bào ni cấy.Bên cạnh đó, các dịng tế bào ung thư mô liên kết như Sarcoma-180, ung
thư máu sẽ sống trôi nổi dạng huyền phù trong mơi trường nên có dạng hình cầu.Dạng tế bào này có thể ni trong các đĩa thủy tinh vô trùng thông thường.Ngồi ra, một số dịng tế bào ung thư sống ở cả 2 dạng trơi nổi và bám dính trong cùng một quần thể nuôi cấy như tế bào ung thư biểu mơ phổi 3LL (Hình1.5).
Hình 1.5: Một số dòng tế bào ung thƣ và dạng sống của chúng
Tế bào ung thư vú MCF7 sống dạng bám dính (A), ung thư mơ liên kết Sarcoma- 180 sống trôi nổi (B), ung thư biểu mô phổi 3LL (C) sống trơi nổi (a) và sống bám
dính (b).
Mơ hình thử nghiệm thuốc này được xem là dễ thực hiện nhất trong các phịng ni cấy tế bào động vật. Nhưng trên thực tế, phải đến năm 1950, sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn lớp phải nhờ vào sự phát triển của môi trường với các thành phần dinh dưỡng thiết yếu cho tế bào đơn lẻ. Cùng với đó, các kỹ thuật nhuộm hóa miễn dịch, miễn dịchhuỳnh quang giúp quá trình đánh giá tác động của thuốc lên tế bào trở lên cụ thể và rõ ràng. Vậy nên, mơ hình ni cấy tế bào đơn lớp mới thực sự phát triển và nhanh chóng trở nên phổ biến trong các phịng thí nghiệm.
Mơ hình này có ưu điểm rất lớn là có thể triển khai nhanh chóng, đơn giản ở hầu hết các phịng thí nghiệm về tế bào. Qua đó, các nhà nghiên cứu có thể sàng lọc được nhiều loại thuốc trong khoảng thời gian ngắn, dễ dàng phân tích tác động của thuốc lên các protein đích hay các q trình trao đổi chất của từng dịng tế bào bằng các biện pháp hóa nhuộm, biện pháp định lượng khác nhau. Nhưng mơ hình lại có nhược điểm là chỉ đánh giá được tác động một chiều từ thuốc tác động lên tế bào đơn lẻ, sự tương trợ của các tế bào trong mô và của hệ thống khác trong cơ thể không được thể hiện trong mơ hình này [1]. Vì vậy, mơ hình ni cấy đơn lớp chỉ thích hợp cho các sàng lọc ban đầu, phân loại tiềm năng của thuốc dựa trên các tiêu chí tác động cụ thể.
1.5.2. Mơ hình ni cấy khối cầu đa bào
Mơ hình được phát triển bắt đầu từ những năm 80 bởi người tiên phong Mina Bissell của phịng thí nghiệm Quốc gia Lawrence Berkeley. Phương pháp ni cấy mới này được cho là bước cải tiến đáng kể so với mơ hình đơn lớp bởi nhiều lý do. Các tế bào mô sống tồn tại trong các vi môi trường 3 chiều với các tương tác giữa tế bào- tế bào và giữa chất nền-tế bào cùng với các phức hệ vận chuyển chất dinh dưỡng cho tế bào mà mơ hình đơn lớp khơng có được, qua đó, các chất sàng lọc trên mơ hình này với kết quả đáng tin cậy hơn về hiệu quả và độc tính của thuốc.
Khối cầu được tạo ra khi tiến hành treo ngược giọt nuôi cấy để sử dụng trọng lực, tập trung các tế bào tại điểm thấp nhất trong giọt treo.Các tế bào được tập trung thành cụm, liên kết với nhau tạo nên khối cầu nhỏ, bắt đầu hình thành tổ chức mơ. Sau vài ngày ni cấy, khối cầu đạt được kích thước và cấu trúc thích hợp sẽ được tiến hành thử thuốc[3].
Khối cầu nuôi cấy được mô tả rất giống với mô in vivo và được cải tiến nhiều để nghiên cứu sự xâm lấn, biệt hóa, tồn tại và phát triển của tế bào ung thư.Sâu hơn nữa, kiểu nuôi cấy khối cầu giúp cho tế bào phân cực chính xác hơn, trong khi ni cấy đơn lớp tế bào chỉ phân cực một phần hoặc khơng chính xác.Với nhiều ưu điểm, mơ hình này đang được sử dụng nhiều hơn trong phịng thí nghiệm nhưng chưa được đưa ra để sàng lọc nhiều vì cần nhiều thao tác cao cấp, phức tạp hơn. Một khối cầu cần nhiều ngày nuôi cấy trước khi đưa vào sàng lọc và độ đồng đều giữa các khối cầu trong sàng lọc cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả sàng lọc nên mơ hình này cịn chưa được phổ biến trong sàng lọc thuốc.
1.5.3. Mơ hình động vật thí nghiệm
Mơ hình này được sử dụng từ rất lâu do kỹ thuật nuôi động vật sống không phức tạp bằng nuôi cấy tế bào. Thực nghiệm cho thấy rằng các tế bào ung thư của khối u ác tính trên cá thể này có thể cấy truyền cho các cá thể khác cùng dòng và các tế bào ung thư này cũng có khả năng phát triển và giết chết vật chủ mới.Hơn nữa, khối u ác tính có cả ở các lồi lưỡng cư, cá, bị sát, chim và động vật có vú nên sử dụng các mơ hình động vật trong nghiên cứu sàng lọc thuốc chống ung thư là hồn tồn có cơ sở khoa học [2]. Nhiều lồi động vật được sử dụng như cá ngựa vằn, gà, thỏ, và đặc biệt là chuột. Chuột có sự tương đồng di truyền cao so với con người và có ưu điểm nổi bật là sinh sản mạnh, điều kiện sinh trưởng không ngặt nghèo nên thường được sử dụng trong phịng thí nghiệm và sàng lọc[9, 14].
Mơ hình này sử dụng cơ thể trưởng thành hồn thiện nên có đầy đủ sự tương tác của nhiều yếu tố như thuốc, khối u, mô lành, hệ miễn dịch.Các tương tác này cho kết quả hoàn toàn đáng tin cậy. Nhược điểm lớn của phương pháp là chịu áp lực về vấn đề thời gian khi bị chi phối bởi quá trình đáp ứng chậm của tồn bộ hệ thống cơ thể so với ni cấy tế bào, cũng như khả năng sống tiềm tàng của động vật thí nghiệm sẽ làm q trình sàng lọc kéo dài nhiều ngày, thậm chí nhiều tuần lễ. Hơn nữa, việc sử dụng động vật nhằm mục đích thí nghiệm cịn liên quan đến vấn đề đạo đức nên còn được sử dụng hạn chế.Như vậy, tùy theo mục đích và quy mơ sàng lọc mà chúng ta sử dụng các mơ hình thích hợp hoặc kết hợp các mơ hình sàng lọc để thu được kết quả nhanh và đáng tin cậy nhất.
Như vậy, có thể thấy dù sử dụng bất kì mơ hình nào cũng sẽ có những ưu nhược điểm riêng. Nhưng dễ thấy rằng, mô hình ni cấy tế bào đơn lớp có khả năng tự động hóa cao, có thể sử dụng nhiều máy móc thay thế cho người làm thí nghiệm đồng thời rút ngắn được thời gian thao tác trên nhiều dòng tế bào với nhiều hợp chất khác nhau. Do vậy, mơ hình này rất phù hợp để sử dụng cho sàng lọc thuốc quy mô lớn, nhất là với sự phát triển một lượng lớn các thuốc có độc tính như hiện nay. Sau đó, mơ hình động vật thí nghiệm sẽ trở thành một mơ hình sàng lọc thứ cấp cho phép ta đánh giá chính xác tác động của thuốc lên khối u trong cơ thể. Việc sử dụng mơ hình ni cấy tế bào đơn lớp như mơ hình sàng lọc sơ cấp sẽ cho phép chúng ta tiết kiệm thời gian cũng như kinh phí khi sàng lọc một số lượng lớn, lựa chọn ra những hợp chất tiêu biểu có tác dụng để tiến đánh giá tác động của thuốc trên cơ thể động vật một cách hiệu quả hơn.Xuất phát từ các cơ sở đã nêu chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có
Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU