2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.3. Phƣơng pháp thử độc tính tế bào trên mơ hình đơn lớp
Ngun lý:
Đây là phương pháp so màu để xác định chỉ số sống của tế bào trong một không gian nuôi cấy xác định. Phương pháp sử dụng muối tetrazolium MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 - (4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium) và một chất truyền điện tử trung gian là PMS (Phenazine methosulfate). MTS sẽ được các enzym dehydrogenase có trong các tế bào sống chuyển đổi thành sản phẩm formazan có màu và có khả năng hồ tan trong mơi trường ni cấy (Hình 2.6). Formazan hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 490 nm. Lượng sản phẩm formazan sinh ra sẽ được định lượng thông qua độ hấp thụ ánh sáng 490 nm, tỷ lệ thuận và phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu (Hình 2.7).
Bố trí thí nghiệm trên đĩa 96 giếng đối với mỗi dòng tế bào: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C1 C2 C3 C4 C5 C6 B C D E C1 C2 C3 C4 C5 C6 F G H Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm MTS ĐCSH H2O Chất 1 Bỏ trống ĐCDM Môi trường Chất 2
Sau khi thu được kết quả đánh giá độc tính của hai chất lên các dòng tế bào, tiếp tục đánh giá độc tính của chế phẩm sinh học trên các dòng tế bào đã bị ảnh hưởng bởi hai chất phân lập được. Nồng độ thử nghiệm là dải gồm 6 nồng độ 1,5, 3, 6, 12, 24, 48 µg/ml và bố trí thí nghiệm giống với chất 1 (Hình 2.8).
Bảng 2.4: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thí nghiệm MTS
Thuốc C1 (µg/mL) C2 (µg/mL) C3 (µg/mL) C4 (µg/mL) C5 (µg/mL) C6 (µg/mL) Chất 1 1,5 3 6 12 24 48 Chất 2 CPSH
Quy trình tiến hành:
Bảng 2.5: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS
Bƣớc chính Chi tiết Ghi chú
Chuẩn bị tế bào
- Chuẩn bị đĩa 96 giếng và tế bào khoẻ mạnh
- Thu tế bào bằng Trypsin-EDTA 1x
- Sử dụng pipet đa kênh để nhả vào mỗi giếng nồng độ: 5000 tế bào/ 180 µl mơi trường/ giếng.
- Đảm bảo mật độ đều giữa các giếng
Pha thuốc và thử thuốc
- Pha dung dịch thuốc trung gian và ĐCDM với nồng độ gấp 10 lần nồng độ cuối cùng thử ở các giếng.
- Nồng độ DMSO cuối là 0,5 %
- Bổ sung 20 µl thuốc tương ứng lên các giếng ghi nhãn tương ứng
- Hồ đều vào mơi trường
- Đặt trong tủ 37°C, 5% CO2, theo dõi trong 48h
Ủ MTS
- Chuẩn bị dung dịch MTS/PMS với tỷ lệ 1PMS:20MTS
- Tránh ánh sáng
- Thêm 30 µl hỗn hợp trên vào mỗi giếng, ủ trong 3 giờ với điều kiện 37°C, 5% CO2
- Tránh ánh sáng
Đo OD - Sử dụng máy Microplate Reader Model
680 để đo kết quả OD của từng giếng
Xử lý số liệu:
Sử dụng phần mềm Excel để xử lý số liệu, tính chỉ số IC50. Chỉ số này là giá trị nồng độ chất thử, tại đó, chất thử có khả năng gây chết 50% tế bào.
Chỉ số IC50 của một chất được tính từ nghiệm phương trình hồi quy biểu diễn tương quan giữa x là nồng độ (hoặc logarit nồng độ) chất thử đó và y là chỉ số tăng sinh A(%) của dịng tế bào được thử, khi y = 50% (Hình 15).
A (%) được tính theo cơng thức:
Trong đó: V: Chỉ số OD trung bình ở các giếng thử thuốc Vh: Chỉ số OD trung bình ở các giếng ĐCDM
Hình 2.9: Xác định chỉ số IC50[25]