Tên Hãng sản xuất
Đĩa nuôi cấy đa giếng: 96 giếng, 24 giếng, 6 giếng Corning, Mỹ
Đĩa, chai nuôi cấy tế bào Corning, Mỹ
Ống ly tâm 1,5 ml; 15 ml; 50 ml Corning, Mỹ
Pipet thuỷ tinh 2 ml, 5 ml, 10 ml Việt Nam
Đầu tip Corning, Mỹ
Ống Cryo Corning, Mỹ
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo YMC RP-18 (30-50 mm, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP- 20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
Sắc ký lỏng trung áp
Sắc ký lỏng trung áp được tiến hành trên máy Biotage - Isolera One system (SE-751 03 Uppsala, Thụy Điển) của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.3.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ hải sâm
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợpxác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạtnhân (NMR).
Phổ NMR đo trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, ViệnHàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (TetrametylSilan).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: 1H-1H COSY, ROESY, HSQC, HMBC.
Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d6, CD3OD-d4, CDCl3, pyridine-d5. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, trên ngun tắc là dung mơi phải hịa tan hồn toàn mẫu thử.
2.3.3. Phƣơng pháp thử độc tính tế bào trên mơ hình đơn lớp
Ngun lý:
Đây là phương pháp so màu để xác định chỉ số sống của tế bào trong một không gian nuôi cấy xác định. Phương pháp sử dụng muối tetrazolium MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 - (4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium) và một chất truyền điện tử trung gian là PMS (Phenazine methosulfate). MTS sẽ được các enzym dehydrogenase có trong các tế bào sống chuyển đổi thành sản phẩm formazan có màu và có khả năng hồ tan trong mơi trường ni cấy (Hình 2.6). Formazan hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 490 nm. Lượng sản phẩm formazan sinh ra sẽ được định lượng thông qua độ hấp thụ ánh sáng 490 nm, tỷ lệ thuận và phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu (Hình 2.7).
Bố trí thí nghiệm trên đĩa 96 giếng đối với mỗi dòng tế bào: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C1 C2 C3 C4 C5 C6 B C D E C1 C2 C3 C4 C5 C6 F G H Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm MTS ĐCSH H2O Chất 1 Bỏ trống ĐCDM Môi trường Chất 2
Sau khi thu được kết quả đánh giá độc tính của hai chất lên các dòng tế bào, tiếp tục đánh giá độc tính của chế phẩm sinh học trên các dòng tế bào đã bị ảnh hưởng bởi hai chất phân lập được. Nồng độ thử nghiệm là dải gồm 6 nồng độ 1,5, 3, 6, 12, 24, 48 µg/ml và bố trí thí nghiệm giống với chất 1 (Hình 2.8).