Tổng hợp trọng lƣợng trung bình của chuột ở các lơ thí nghiệm

Bảng 3.3: Tổng hợp trọng lƣợng trung bình của chuột ở các lơ thí nghiệm Lần cân Lần cân

Lơ

Lần cân

Ngày 1 Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Ngày 15 Ngày 18 Ngày 21 Ngày 24

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Lần 7 Lần 8 Lần 9

ĐCSH 20.2±1.3 23±0.9 26.4±1.0 34.2±1.1 38±2.4 43±1.6 46±2.7 47.4±2.1 49±4

ĐCUT 20.3±1.3 22.9±1.5 26.3±1.5 32.9±1.8 35.1±2.6 40.1±2.5 41±3.1 43.2±3.1 44.1±4.4

UT+6MP 20.4±1.1 23±1.2 25.9±1.2 28.3±1.6 31.6±3.3 29.6±2.05 30.9±2.1 33.3±2.7 33.3±3.6

UT+CPSH 20.2±1.4 23.3±1.8 27.1±1.8 29.3±1.7 32.1±3.03 35.9±2.9 37.5±5.1 39.7±3.2 39.5±2.8

Hình 3.28: Đồ thị biểu diễn sự tăng trọng lƣợng các lơ ung thƣ trong q trình thí nghiệm

Về hình thái chung , chuột mang u rắn được thử nghiệm với chế phẩm cũng như các lơ như ĐCSH và ĐCUT đều có th ể trạng tốt khơng có hiện tượng bỏ ăn , tính chất phân khơng bất thường , lông không sù, chậm chạp hay một số biểu hiện đặc biệt như run rẩy, co giật. Trọng lượng cơ thể chuột ở các lô đối chứng tăng đều, phản ánh tình trạng sức khỏe đạt yêu cầu để làm đối chứng. Ở lô UT+6MP có các biểu hiê ̣n sau thử nghiê ̣m ở lần 7 (ngày thứ 14 sau cấy ghép ) như chuô ̣t bắt đầu ăn uống ít, lông xù, sút cân, ít hoạt động và càng các lần thử sau càng thể hiện rõ . Hiện

Trọng lƣợng chuột trong q trình thí nghiệm

Lần cân P

(g)

tượng này có thể là do tác dụng phụ của thuốc 6MP ảnh hưởng đến cơ thể chuột. Qua đó, có thể thấy rằng chế phẩm khơng có tác động gây độc, an toàn cho chuột mang u rắn khi được thử nghiệm với liều như trên.

Kết quả kháng u rắn Sarcoma 180 dưới da của chế phẩm

30 chuột được cấy ghép u với tế bào ung thư Sarcoma 180 được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con là ĐCUT, UT+CPSH, UT+6MP.Kết quả quan sát khối u tính đến

ngày thứ 32 sau cấy ghép u và cũng là ngày kết thúc đợt thử nghiệm bằng CPSH,

kích thước khối u ở lô chuột được thử nghiệm với thuốc 6MP (chứng dương) là nhỏ nhất và đã tiêu biến rất đáng kể so với ban đầu (Hình 3.29). Kích thước khối u ở lơ ĐCUT khơng thử nghiệm thuốc có thích thước lớn nhất và tại thời điểm này hầu hết khối u ở lô này đều to và có xuất hiê ̣n lõi hoa ̣i tử rõ ràng . Đối với lô UT+CPSH, chỉ 1/3 số khối u xuất hiện lõi hoại tử. Như vậy, cho đến ngày 32, kích thước khối u của lơ UT+CPSH nhỏ hơn lô ĐCUT và lớn hơn lô đối chứng dương UT+6MP. Sự chênh lệch về kích thước khối trong suốt q trình thí nghiệm được thể hiện rõ qua bảng 3.4.

Hình 3.29: Hình ảnh khối u ở chuột tại các lơ thí nghiệm vào ngày thứ 32 sau cấy u

Trong quá trình thử nghiệm đo kích thước khối u (cm3) và đư ợc xác định theo công thức (1) từ ngày thứ 7 sau cấy ghép u và là ngày b ắt đầu thử nghiệm

ĐCUT UT+CPSH UT+6MP 2.90cm3 0.44cm 3 1.37cm3

CPSH. Từ kết quả đo, xác định đươ ̣c kích thư ớc trung bình của khối u của từng lơ chuột thí nghiệm.

Bảng 3.4: Theo dõi kích thƣớc khối u trong q trình thử nghiệm Ngày Lô Ngày 5 (lần 1) Ngày 8 (lần 2) Ngày 11 (lần 3) Ngày 13 (lần 4) Ngày 16 (lần 5) Ngày 19 (lần 6) Ngày 21 (lần 7) Ngày 23 (lần 8) Ngày 26 (lần 9) ĐCUT 0.05±0.02 0.25±0.08 0.55±0.2 1.04±0.3 1.43±0.3 2.37±0.3 2.57±1.0 2.69±1.1 2.91±1.2 UT+6MP 0.05±0.02 0.19±0.1 0.26±0.2 0.28±0.2 0.39±0.2 0.38±0.2 0.39±0.2 0.46±0.2 0.44±0.2 UT+CPSH 0.06±0.01 0.17±0.1 0.37±0.2 0.62±0.4 0.92±0.4 1.22±0.9 1.276±0.6 1.29±0.7 1.37±0.9

Qua bảng 3.4 và hình 3.30, kích thước khối u cấy ghép dưới da ở lô chuột đối chứng ung thư tăng đều qua mỗi lần đo do không được điều trị với thuốc. Đến lần đo thứ 9 (cuối cùng), kích thước khối u đã tăng trung bình khoảng 58,2 lần (từ 0,05 đến 29,1 cm3). Kích thước khối u của lô UT+6MP, do được điều trị với thuốc đối chứng 6MP nên kích thước khối u tăng rất chậm so với hai lơ cịn lại. Sau 26 ngày, kích thước khối u chỉ tăng 8,8 lần (từ 0,05 đến 0,44 cm3), thậm chí cịn giảm nhẹ trong những ngày điều trị cuối. Điều này một lần nữa khẳng định sự hiệu quả trong điều trị kháng u của 6MP và lựa chọn 6MP làm đối chứng dương là chính xác.

Hình 3.30: Đồ thị tăng trƣởng kích thƣớc trung bình của u rắn ở các lơ thí nghiệm

Đồ thị hình 3.28 cho thấy CPSH có khả năng kháng u khá tốt. Kích thước

3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kích t h ước ( V m 3) Lần đo Kích thƣớc u ở các lơ thí nghiệm ĐCUT UT+6MP UT+CPSH

CPSH đã kìm hãm sự phát triển của khối u xấp xỉ 53%, và hiệu quả kháng u bằng 38,6% thuốc 6MP.

Dựa trên những kết quả này chúng tôi đánh giá được mức độ phát triển khối u dưới tác dụng của chế phẩm. Khả năng ức chế và sự phát triển khối u của CPSH thông qua tỷ số ức chế IR% và tỷ số phát triển GR%. Từ hai tỷ số này dựa vào thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa (Bảng 2.9) để xác định được hiệu lực kháng. Kết quả thu được của các chỉ tiêu nghiên cứu được tổng hợp ở bảng 3.5.

Bảng 3.5: Tổng hợp kết quả khảo sát tác dụng kháng u của CPSH trên chuột mang u rắn Sar.180

TT Các chỉ tiêu theo dõi ĐCUT UT+CPSH UT+6MP

1 Số lượng chuột thí nghiệm 10 10 10

2 Số lượng chuột khi kết thúc thí nghiệm 10 10 8

3 Tỷ lệ tạo u (%) 100 100 100

4 Tỷ lệ không tạo u (%) 0 0 0

5 Kính thước trung bình u(mm) 2.900 1,370 0.440

6 GR (theo Kích thước trung bình u) 100 47.35 15.26

7 IR (theo Kích thước trung bình u) 0 52.65 84.74

8 Hiệu lực kháng u (theo Itokawa) 0 + ++

Như vậy, dựa vào thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa, kết quả thu được về hiệu quả kháng u như sau:

- Đối với CPSH (UT+CPSH) tỷ số ức chế IR% tương ứng là 52.65%, đạt hiệu lực kháng u (+).

- Đối với thuốc chứng dương 6MP tỷ số này là 84.74%, đạt hiệu lực kháng u (++).

Kết quả ảnh hưởng của chế phẩm lên một số chỉ số huyết học máu ngoại vi của chuột trong nghiên cứu

Các lơ thí nghiệm sau thử nghiệm th́c và CPSH bằng cách đưa thuốc qua thực quản (per.os), cùng 2 lô đối chứng: đối chứng sinh học và đối chứng ung thư sau đợt thử nghiệm các cá thể chuô ̣t đư ợc mổ, lấy máu ngoại vi đem phân tích 20 thơng số bằng máy phân tích sinh hóa máu tự động Swelab Alpha , Thụy Điển t ại Học viện Quân Y 103. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.6.

Bảng 3.6: Các chỉ số huyết học của chuột ở các lơ thí nghiệm và đối chứng

STT Chỉ số huyết học ĐCSH ĐCUT UT+6MP UT+CPSH

1 Bạch cầu(3,0-14,2) 5.40 11.72 3.10 22.83

2 Hồng cầu (5,0-9,5) 7.77 7.58 2.18 7.40

3 Hemoglobin 12.58 12.16 3.80 12.16

4 Hồng cầu trong máu (%) 38.46 37.24 10.62 36.60

5 Thể tích khối tiểu cầu 0.40 0.35 0.66 0.39

6 Tế bào Lympho (3,22-11,2) 4.70 9.16 2.90 8.28

7 Bạch cầu hạt 0.14 0.54 0.05 1.03

Qua bảng số liệu (Bảng 3.6) có thể thấy các chỉ số huyết học như hồng cầu, lượng bạch cầu các loại của lơ ĐCSH đều nằm trong mức bình thường [6]. Chuột ở lơ ĐCUT có nhiều chỉ số tăng so với ĐCSH nhưng vẫn nằm trong giới hạn sinh lý bình thườngchứng tỏ sự ổn định trong tình trạng sức khỏe của chuột thí nghiệm.

Chuột ở các lơ thử nghiệm thuốc đều có nhiều thay đổi về chỉ số huyết học. Lơ UT+6MP có thay đổi ở cả hồng cầu, tiểu cầu và các loại bạch cầu và chúng có xu hướng giảm, có thể do chất này có tính độc khi có mặt trong cơ thể chuột. Điều này cũng được thể hiện khi 6MP gây ra nhiều tác dụng phụ trên chuột khiến chuột ăn ít và chết sớm hơn bình thường (mặc dù hiệu quả kháng u tốt).Ngồi ra, thuốc 6MP có thể ảnh hưởng xấu đến một số cơ quan sinh miễn dịch như tuyến ức nên lượng bạch cầu lympho giảm đáng kể.

Lơ chuột UT+CPSH có chỉ số bạch cầu tăng và chỉ số hồng cầu giữ được ở mức sinh lý bình thường.CPSH có thể làm kích thích hệ thống miễn dịch, tăng khả năng đáp ứng của cơ thể, qua đó kìm hãm khối u phát triển.Nhưng kết quả này cần được xác định chính xác sự kích thích miễn dịch là do CPSH hay do các yếu tố ngoại lai hay tổn thương khác. Do giữ được các chỉ số huyết học khá cân bằng so với 6MP nên có thể chuột ở lơ UT+CPSH có sức sống tốt hơn lô UT+6MP. Điều này rất phù hợp với những ghi nhận được từ thí nghiệm trên chuột khi CPSH khơng gây ra các biểu hiện bất thường trên chuột thí nghiệm.Nhóm nghiên cứu của Zhang Y, Yi Y cho biết chất colochiroside A tuy có khả năng ức chế mạnh Sarcoma 180 nhưng về mặt miễn dịch, chất này không tác động đáng kể đến sự phát triển của tuyến ức [20] nên sự tác động lên hệ thống miễn dịch của CPSH đối với lơ chuột thí nghiệm có thể khơng phải vai trò của chất colochiroside A. Như vậy, CPSH thể hiện tính kháng u khơng mạnh bằng đối chứng 6MP nhưng không gây ảnh hưởng

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được trong các thí nghiệm trên, chúng tơi rút ra những kết luận sau:

1. Phân lập được hai hợp chất tritecpen saponin là colochiroside A và philinopside A từ loài hải sâm Cercodemas anceps thu thập tại vùng biển Đông Bắc Việt Nam. Hợp chất philinopside A lần đầu tiên được cơng bố từ lồi hải sâm C. anceps.

2. Hợp chất colochiroside A và philinopside A thể hiện hoạt tính diệt tế bào ung thư trên dịng tế bào ung thư mơ liên kết Sarcoma 180 với giá trị IC50 tương ứng là 12,59 và 30,20 µg/ml.Hoạt tính diệt trên bào ung thư trên dịng MCF7 có giá trị IC50 lần lượt là 6,97 và 7,93 µg/ml. Hai hợp chất này chưa

ảnh hưởng đến dòng tế bào ung thư HCT116 trong dải nồng độ khảo sát. 3. Chế phẩm sinh họccó khả năng ứng chế dịng tế bào Sarcoma180 và MCF7

với IC50 lần lượt là 5,26 và 6,46 µg/ml; có hoạt tính gây chết tế bào ung thư

Sarcoma 180 và MCF7 từ nồng độ 10 µg/ml; có tác dụng ức chế sự tăng trưởng khối u rắn in vivo, giảm 52,65% kích thước u, đạt hiệu lực kháng u

(+) một cộng so với thuốc điều trị ung thư đối chứng 6MP đạt hiệu lực kháng

u (++).

KIẾN NGHỊ

1. Thử tác dụng của các hợp chất trên nhiều dòng tế bào ung thư hơn để đánh giá độ đặc hiệu của chất đối với các dịng ung thư.

2. Nghiên cứu con đường tín hiệu gây chết theo chương trình của 2 hợp chất. 3. Phối hợp các loại saponin vốn có khả năng diệt tế bào ung thư với 2 hợp chất

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Như Hiền, Trịnh Xuân Hậu (2006), "Tế bào học". Nhà xuất bản

Đạihọc Quốc Gia Hà Nội.

2. Phùng Phướng, Nguyễn Văn Cầu, Nguyễn Trần Thúc Huân (2005), "Ung thưhọc đại cương". Đại học Y Dược Huế.

3. Lê Đình Sáng (2010), "Bệnh học ung thư". Đại học Y Khoa Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh

1. Freshney RI (2005), Culture of specific cell types, Wiley Online Library, 2. Teicher BA, Andrews PA (2004), Anticancer drug development guide,

Springer Science & Business Media,

3. Freshney RI Culture of animal cells, a manual of basic technique, John Wiley and Sons, inc,

4. Abou-Ghali M, Stiban J (2015), "Regulation of ceramide channel formation and disassembly: Insights on the initiation of apoptosis".Saudi journal of biological

sciences, 22 (6), p. 760-772.

5. Drozdova OA, Avilov SA, Kalinin VI, Kalinovsky AI, Stonik VA, Riguera R, Jiménez C (1997), "Cytotoxic Triterpene Glycosides from Far‐ Eastern Sea Cucumbers Belonging to the Genus Cucumaria".Liebigs Annalen, 1997 (11), p. 2351-2356.

6. Dzieciolowska EW (2009), "Selected peripheral blood cell parameters in twelve inbred strains of laboratory mice".Animal Science Papers and Reports, 27 (p. 69-77.

7. Hanahan D, Weinberg RA (2011), "Hallmarks of cancer: the next generation".cell, 144 (5), p. 646-674.

8. Kalinin VI, Silchenko AS, Avilov SA, Stonik VA, Smirnov AV (2005), "Sea cucumbers triterpene glycosides, the recent progress in structural elucidation and chemotaxonomy".Phytochemistry Reviews, 4 (2-3), p. 221-236.

9. Kennedy BK (2014), "Similarities and differences between mice and humans revealed".Pann State, p.

10. Lee M-S, Chan JY-W, Kong S-K, Yu B, Eng-Choon VO, Nai-Ching HW, Mak Chung-Wai T, Fung K-P (2005), "Effects of polyphyllin D, a steroidal saponin in Paris polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer cells and in xenograft".Cancer biology & therapy, 4 (11), p. 1248-1254.

11. Man S, Gao W, Zhang Y, Huang L, Liu C (2010), "Chemical study and medical application of saponins as anti-cancer agents".Fitoterapia, 81 (7), p. 703- 714.

12. Mariño G, Kroemer G (2013), "Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure".Cell research, 23 (11), p. 1247-1248.

13. Rao A, Sung M (1995), "Saponins as anticarcinogens".The Journal of

nutrition, 125 (3 Suppl), p. 717S-724S.

14. Sharpless NE, DePinho RA (2006), "The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development".Nature reviews Drug

discovery, 5 (9), p. 741-754.

15. Silchenko AS, Kalinovsky AI, Avilov SA, Andryjashchenko PV, Dmitrenok PS, Kalinin VI, Stonik VA (2012), "3β-O-Glycosylated 16β-acetoxy-9β-H-lanosta- 7, 24-diene-3β, 18, 20β-triol, an intermediate metabolite from the sea cucumber Eupentacta fraudatrix and its biosynthetic significance".Biochemical Systematics

and Ecology, 44 (p. 53-60.

16. Sparg S, Light M, Van Staden J (2004), "Biological activities and distribution of plant saponins".Journal of ethnopharmacology, 94 (2), p. 219-243. 17. Tong Y, Zhang X, Tian F, Yi Y, Xu Q, Li L, Tong L, Lin L, Ding J (2005), "Philinopside a, a novel marine‐ derived compound possessing dual anti‐ angiogenic and anti‐ tumor effects".International journal of cancer, 114 (6), p. 843-853.

18. Yi YH, Xu QZ, Li L, Zhang SL, Wu HM, Ding J, Tong YG, Tan WF, Li MH, Tian F (2006), "Philinopsides A and B, two new sulfated triterpene glycosides

from the sea cucumber Pentacta quadrangularis".Helvetica chimica acta, 89 (1), p. 54-63.

19. ZHANG Y-j, YI Y-h "Antitumor activities in vitro of the triterpene glycoside Colochiroside A from sea cucumber Colochirus anceps". p.

20. Zhang Y, Yi Y (2011), "[Studies on antitumor activities of triterpene glycoside colochiroside A from sea cucumber Colochirus anceps]".Zhongguo

Zhong yao za zhi= Zhongguo zhongyao zazhi= China journal of Chinese materia medica, 36 (4), p. 504-507.

21. Zhang Y. J. LXJ, Yi Y. H. (2005), "A new triterpene glycoside from the seacucumber Colochirous anceps".Chinese Journal of Marine Drugs, 24(2) (p. 13- 17.

22. Phùng Phướng NVC, Nguyễn Trần Thúc Huân (2005), "Ung thư học đại cương".Đại học Y Dược Huế, p.

23. Sáng LĐ (2010), "Bệnh học ung thư".Đại học Y Khoa Hà Nội., p.

24. Diwan FH(1) A-HI, Mohammed ST (2000 Mar-May), "Effect of saponin on mortality and histopathological changes in mice".East Mediterr Health J, 6(2- 3):345-51 (p. 25. Voigt W (2005), Sulforhodamine B assay and chemosensitivity, Springer,

26. Adams J, Cory S (2007), "The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy".Oncogene, 26 (9), p. 1324-1337.

27. Bhowmick NA, Neilson EG, Moses HL (2004), "Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression".Nature, 432 (7015), p. 332-337.

28. Cheng N, Chytil A, Shyr Y, Joly A, Moses HL (2008), "Transforming growth factor-β signaling–deficient fibroblasts enhance hepatocyte growth factor signaling in mammary carcinoma cells to promote scattering and invasion".Molecular Cancer Research, 6 (10), p. 1521-1533.

29. Grivennikov SI, Greten FR, Karin M (2010), "Immunity, inflammation, and cancer".Cell, 140 (6), p. 883-899.

30. Lowe SW, Cepero E, Evan G (2004), "Intrinsic tumour suppression".Nature, 432 (7015), p. 307-315.