Các dịng tế bào được bảo quản đơng lạnh trong nitơ lỏng được rã đơng, sau đó ni trong mơi trường RPMI và DMEM (10% FBS, 1% Peniciline/ Steptomycine) để nhân lên một số lượng lớn đủ để tiến hành thí nghiệm xác định giá trị IC50 của chế phẩm và cấy ghép tạo u thực nghiệm trên động vật.
Ba dịng tế bào là ung thư mơ liên kết Sarcoma-180, ung thư vú MCF7 và ung thư đại tràng HCT116 được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 5000 tế bào trong 180ml môi trường nuôi cấy. Sau 24 giờ, khi tế bào đã ổn định, chuẩn bị dãy nồng độ thử nghiệm như trong Bảng 2.4 và bố trí thí nghiệm như Hình2.9.
Sau 48 giờ thử nghiệm trong điều kiện nuôi cấy 37oC, 5% CO2, chúng tôi nhận thấy mặc dù thử nghiệm ở dải nồng độ khá rộng nhưng đối dòng tế bào HCT116, hai hợp chất này thể hiện hiệu quả tiêu diệt tế bào thấp ở các dải nồng độ đã khảo sát. Cả hai chất đều khơng có nồng độ nào cho chỉ số A% thấp hơn 50%. Hai nồng độ cao nhất của chất 1 là 48 và 24 µg/ml cho chỉ số A% đều lớn hơn 60%. Bốn nồng độ cao nhất của chất 2 là 48, 24, 12 và 6 µg/ml cho kết quả gần như nhau và đều lớn hơn 80% (Hình 3.15). Đặc biệt, hai nồng độ thấp nhất của chất 2 là 1,5 và 3 µg/ml có chỉ số tăng sinh cao hơn mẫu đối chứng khoảng 10%, chứng tỏ ở hai nồng độ này, chất 2 khơng có tác dụng ức chế tế bào HCT116. Do hai hợp chất khơng thể hiện độc tính với HCT116 nên dịng tế bào này không được sử dụng ở các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.15: Đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào HCT116 với hai chất
A (chất 1), B (chất 2)
Bên cạnh đó, hai hợp chất này có cho thấy khả năng gây độc lên dòng tế bào Sarcoma-180 trong dải nồng độ khảo sát. Tuy nhiên mức độ tác động không mạnh và thể hiện ở đường cong đáp ứng liều hình 3.16.Sự đáp ứng của Sarcoma-180 đối với cả hai chất ở những nồng độ cao 48, 24, 12 µg/ml đều gần như nhau và xấp xỉ mức 50%. Nồng độ thấp của chất 2 là 1,5 và 3 µg/ml tác động lên Sarcoma-180 giống như đối với dịng HCT116.
Hình 3.16: Đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào Sar-180 với hai chất
A (chất 1), B (chất 2)
Dựa vào kết quả gây độc, đường cong đáp ứng liều, chỉ số IC50 của hợp chất 1 và hợp chất 2 lên dòng tế bào Sarcoma-180 có giá trị lần lượt là 12,59 và 30,20 µg/ml với chỉ số tương quan R2 tương ứng là 0,978 và 0,995.
Khả năng gây độc của hai hợp chất này thể hiện trên dòng tế bào MCF7 rõ ràng hơn hai dòng tế bào còn lại. Tuy hai nồng độ thấp của hai hợp chất là 1,5 và 3 µg/ml cho thấy mức độ tác động cịn chưa rõ ràng (chỉ số tăng sinh khoảng 80%), nồng độ thứ ba là 6 µg/ml đã cho thấy mức tác động mạnh hơn, chỉ số tăng sinh đã giảm đến khoảng 50% ở cả hai hợp chất. Ba nồng độ cao nhất là 12, 24 và 48 µg/ml của cả hai hợp chất tác động mạnh nhất và cho kết quả khá tương đồng khi chỉ số tăng sinh ở mức 40 – 30% và đang có xu hướng giảm rất chậm (Hình 3.17). Hiện tượng này có thể do khi ở các nồng độ cao, tế bào đã có cơ chế làm dừng sự thâm nhập của thuốc, khiến cho dải nồng độ dù có tăng cao thì chỉ số tăng sinh của quần thể khơng cịn thay đổi nhiều.
Hình 3.17: Đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào MCF7 với hai chất
A (chất 1), B (chất 2)
Dựa trên kết quả thử độc tính, đường cong đáp ứng liều, chỉ số IC50 của hợp chất 1 và 2 tác động lên dịng tế bào MCF7 được tính lần lượt là 6,97 và 7,93 µg/ml với chỉ số tương quan R2 tương ứng là 0,943 và 0,971.
Trong thí nghiệm này, hai chất ở dạng đơn lẻ cũng được nghiên cứu về độc tính ở trên thế giới. Chất 1- colochiroside A được tách chiết từ Colochirus ancepscho thấy hiệu quả độc tính trên năm dịng tế bào ung thư BEL-7402, HO-
8910, MDA-MB-435, MDA-MB-468, A431 với IC50 khá thấp từ 1,75μg/ml- 3,66μg/ml[19]. Một nghiên cứu khác cho thấy chất 1 có khả năng ức chế các dịng tế bào HL60, A-549, SpC-A4, MKN-28và SGC-7901 với IC50 là 3,61 ± 0,55μg/ml[20] và riêng đối với dịng Sarcoma 180, colochiroside A có thể ức chế từ 36,4% đến 70%. Tuy không sử dụng cùng loại tế bào để xác định chỉ số IC50 nhưng có thể thấy khả năng chống lại sự phát triển của tế bào ung thư nói chung của chất colochiroside A.
Chất 2 - philinopside A từng được phân lập từ loài Pentacta quadrangularisđã được chứng minh có khả năng chống ung thư, gây độc tế bào,
chống hình thành mạch dựa trên khả năng ức chế RTKs [17]. Nghiên cứu cho biết thêm tiềm năng chống ung thư khi chất này có thể ức chế khả năng tăng sinh, xâm lấn và hệ thống khung xương tế bào nội mô mao mạch (HMECs) ở các giá trị nồng độ lần lượt là 1,4± 0,17, 0,89 ± 0,23 and 0,98 ± 0,19 µM.