2.1.5. Dịng tế bào ung thƣ biểu mơ ruột kết HCT116
Dòng tế bào này là tế bào ung thư biểu mơ ruột kết người có dạng hình sao do tế bào bám dính trên bề mặt ni cấy (Hình 2.4) với thời gian nhân đơi là 29 giờ và nuôi cấy trong môi trườngRMPI + 10% FBS + 1% P-S.
Hình 2.4: Tế bào ung thƣ biểu mơ ruột kết HCT116 trong nghiên cứu
2.1.6. Chuột nhắt trắng Swiss
Chuột Swiss (Mus musculus) do cơ sở nuôi động vật của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp với đặc điểm nhưchuột có trọng lượng trung bình 18-20g, được ni dưỡng bằng thức ăn dạng viên nén, uống nước đun sôi để nguội. Nước uống và trấu lót chuồng được thay hằng ngày.
Hình 2.5: Chuột nhắt trắng Swiss (Mus musculus) trong nghiên cứu
2.2. Hoá chất, thiết bị
2.2.1. Hoá chất
Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
Tên Hãng sản xuất
DMSO-d6, CD3OD-d4, CDCl3, pyridine-d5 Mỹ
H2SO4 10% Việt Nam
Silica gel RP-18 Nhật Bản
Nhựa trao đổi ion Dianion HP-20 Nhật Bản
TMS (Tetrametyl Silan) Mỹ
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 11885
Gibco, Mỹ
RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium)1640
Gibco, Mỹ
FBS (Fetal Bovine Serum) Invitrogen, Mỹ
P-S (Penicillin-Streptomicine) Invitrogen, Mỹ
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Gibco, Mỹ
Trypsin Invitrogen, Mỹ
PBS (Phosphate Buffered Saline) Gibco, Mỹ
Blue Trypan Gibco, Mỹ
MTS Promega, Mỹ
PMS (Phenazine methosulfate) Promega, Mỹ
PFA (Paraformaldehyde) 4% Sigma, Mỹ
Triton-X Sigma, Mỹ
BSA (Bovince Serum Albumin) Sigma, Mỹ
Annecxin V Invitrogen, Mỹ
PI Invitrogen, Mỹ
2.2.2. Thiết bị
Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên Hãng sản xuất
DC-Alufolien 60 F254, RP18 F254s Merk, Đức
Máy Bruker AM500 FT-NMR Bruker, Mỹ
Máy Biotage-Isolera One system Thụy Điển
Máy Swelab Alpha Thụy Điển
Tủ hood Esco, Mỹ
Tủ ấm 5% CO2 Shel Lab, Mỹ
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss, Đức
Bể ổn nhiệt Gra Operation SS40-1 Đức
Máy votex WhirliMixer Anh
Máy ly tâm Universal 320 Hettich, Pháp
Microplate Reader Model 680 Bio-Rad, Nhật Bản
Pipet aid Gilson, Pháp
Pipet man Gilson, Pháp
Kính hiển vi laze quét đồng tụ LSM 510 Carl Zeiss, Đức
Buồng đếm tế bào Thomas, Đức
2.2.3. Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao
Bảng 2.3: Dụng cụ và vật tƣ dùng trong thí nghiệm
Tên Hãng sản xuất
Đĩa nuôi cấy đa giếng: 96 giếng, 24 giếng, 6 giếng Corning, Mỹ
Đĩa, chai nuôi cấy tế bào Corning, Mỹ
Ống ly tâm 1,5 ml; 15 ml; 50 ml Corning, Mỹ
Pipet thuỷ tinh 2 ml, 5 ml, 10 ml Việt Nam
Đầu tip Corning, Mỹ
Ống Cryo Corning, Mỹ
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo YMC RP-18 (30-50 mm, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP- 20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
Sắc ký lỏng trung áp
Sắc ký lỏng trung áp được tiến hành trên máy Biotage - Isolera One system (SE-751 03 Uppsala, Thụy Điển) của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ hải sâm
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợpxác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạtnhân (NMR).
Phổ NMR đo trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, ViệnHàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (TetrametylSilan).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: 1H-1H COSY, ROESY, HSQC, HMBC.
Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d6, CD3OD-d4, CDCl3, pyridine-d5. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, trên ngun tắc là dung mơi phải hịa tan hồn tồn mẫu thử.
2.3.3. Phƣơng pháp thử độc tính tế bào trên mơ hình đơn lớp
Ngun lý:
Đây là phương pháp so màu để xác định chỉ số sống của tế bào trong một không gian nuôi cấy xác định. Phương pháp sử dụng muối tetrazolium MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 - (4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium) và một chất truyền điện tử trung gian là PMS (Phenazine methosulfate). MTS sẽ được các enzym dehydrogenase có trong các tế bào sống chuyển đổi thành sản phẩm formazan có màu và có khả năng hồ tan trong mơi trường ni cấy (Hình 2.6). Formazan hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 490 nm. Lượng sản phẩm formazan sinh ra sẽ được định lượng thông qua độ hấp thụ ánh sáng 490 nm, tỷ lệ thuận và phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu (Hình 2.7).
Bố trí thí nghiệm trên đĩa 96 giếng đối với mỗi dòng tế bào: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C1 C2 C3 C4 C5 C6 B C D E C1 C2 C3 C4 C5 C6 F G H Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm MTS ĐCSH H2O Chất 1 Bỏ trống ĐCDM Môi trường Chất 2
Sau khi thu được kết quả đánh giá độc tính của hai chất lên các dịng tế bào, tiếp tục đánh giá độc tính của chế phẩm sinh học trên các dòng tế bào đã bị ảnh hưởng bởi hai chất phân lập được. Nồng độ thử nghiệm là dải gồm 6 nồng độ 1,5, 3, 6, 12, 24, 48 µg/ml và bố trí thí nghiệm giống với chất 1 (Hình 2.8).
Bảng 2.4: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thí nghiệm MTS
Thuốc C1 (µg/mL) C2 (µg/mL) C3 (µg/mL) C4 (µg/mL) C5 (µg/mL) C6 (µg/mL) Chất 1 1,5 3 6 12 24 48 Chất 2 CPSH
Quy trình tiến hành:
Bảng 2.5: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS
Bƣớc chính Chi tiết Ghi chú
Chuẩn bị tế bào
- Chuẩn bị đĩa 96 giếng và tế bào khoẻ mạnh
- Thu tế bào bằng Trypsin-EDTA 1x
- Sử dụng pipet đa kênh để nhả vào mỗi giếng nồng độ: 5000 tế bào/ 180 µl mơi trường/ giếng.
- Đảm bảo mật độ đều giữa các giếng
Pha thuốc và thử thuốc
- Pha dung dịch thuốc trung gian và ĐCDM với nồng độ gấp 10 lần nồng độ cuối cùng thử ở các giếng.
- Nồng độ DMSO cuối là 0,5 %
- Bổ sung 20 µl thuốc tương ứng lên các giếng ghi nhãn tương ứng
- Hồ đều vào mơi trường
- Đặt trong tủ 37°C, 5% CO2, theo dõi trong 48h
Ủ MTS
- Chuẩn bị dung dịch MTS/PMS với tỷ lệ 1PMS:20MTS
- Tránh ánh sáng
- Thêm 30 µl hỗn hợp trên vào mỗi giếng, ủ trong 3 giờ với điều kiện 37°C, 5% CO2
- Tránh ánh sáng
Đo OD - Sử dụng máy Microplate Reader Model
680 để đo kết quả OD của từng giếng
Xử lý số liệu:
Sử dụng phần mềm Excel để xử lý số liệu, tính chỉ số IC50. Chỉ số này là giá trị nồng độ chất thử, tại đó, chất thử có khả năng gây chết 50% tế bào.
Chỉ số IC50 của một chất được tính từ nghiệm phương trình hồi quy biểu diễn tương quan giữa x là nồng độ (hoặc logarit nồng độ) chất thử đó và y là chỉ số tăng sinh A(%) của dịng tế bào được thử, khi y = 50% (Hình 15).
A (%) được tính theo cơng thức:
Trong đó: V: Chỉ số OD trung bình ở các giếng thử thuốc Vh: Chỉ số OD trung bình ở các giếng ĐCDM
Hình 2.9: Xác định chỉ số IC50[25]
2.3.4. Phƣơng pháp xác định tế bào apoptosis dƣới tác dụng của CPSH
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang để xác định các tế bào chết theo chương trình. Phương pháp phụ thuộc vào sự xuất hiện của phosphatidylserin (PS) và các ion canxi trên màng của những tế bào có dấu hiệu chết theo chương trình sớm. Kháng thể Annexin V kết hợp với thuốc nhuộm có phát huỳnh quang Alexa Four488/PI sẽ gắn vào PS trên bề mặt những tế bào này(Hình 16). Dưới bước sóng kích thích, những tế bào nào được ghi nhận tín hiệu huỳnh quang chính là những tế bào đang chết theo chương trình.
Quy trình tiến hành:
Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định tế bào chết theo chƣơng trình
Tế bào Sarcoma 180 Tế bào ung thƣ vú MCF7
ĐCSH 24h CPSH (10µg/ml) 24h CPSH (20µg/ml) 24h CPSH (40µg/ml) 24h CPSH (10µg/ml) 24h CPSH (20µg/ml) 24h CPSH (40µg/ml) 24h ĐCSH 24h
Bảng 2.7: Quy trình tiến hành thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang
Bƣớc chính Chi tiết Ghi chú
Hoạt hố và nuôi tế bào
- Rã đông tế bào từ -196°C trong bể ổn nhiệt 37°C.
- Nhanh chóng rã đông trong 1 phút
- Ly tâm 1000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch nổi.
- Hồ đều tế bào vào mơi trường mới, cho vào đĩa nuôi cấy đặt trong tủ 37°C, 5% CO2
- Tách tế bào thành dạng đơn lẻ
- Thay môi trường thường xuyên 2-3 ngày/ lần
- Cấy chuyển tế bào khi mật độ tế bào đạt 70 – 90% bề mặt nuôi cấy bằng Trypsin - EDTA 1x trong 5 phút, 37°C.
- Chuyển sang chai nuôi cấy mới
Chuẩn bị coverslip (chỉ đối với dịng tế bào bám dính)
- Chuẩn bị coverslip, đĩa 24 giếng
- Đặt các coverslip vào mỗi giếng, rửa bằng PBS 1x, để khô dưới tia UV 1 giờ
Chuẩn bị tế bào
- Đảm bảo tế bào khoẻ mạnh, không nhiễm - Thu tế bào bằng Trypsin – EDTA 1x
- Nhả tế bào vào trong mỗi giếng với mật độ 120 000 tế bào/ 450 µl mơi trường/ giếng
- Đảm bảo mật độ đều giữa các giếng
- Đặt vào tủ 37°C, 5% CO2, nuôi ổn định
Pha thuốc và thử thuốc
nồng độ gấp 10 lần nồng độ cuối cùng thử ở các giếng
- Bổ sung 50 µl thuốc tương ứng lên các giếng ghi nhãn tương ứng
- Hồ đều vào mơi trường
- Đặt trong tủ 37°C, 5% CO2, theo dõi trong 24 giờ Cố định tế bàođối với dịng TB bám dính - Rửa bằng PBS 1X, cố định bằng PFA 4% - Rửa bằng PBS 1X, tạo tính thấm bằng Triton X
0,5%
- Rửa bằng PBS 1X, tăng tính đặc hiệu bằng BSA 5%
Cố định tế bào đối với dịng TB trơi nổi
- Ly tâm 1000rpm, 5’ để thu tế bào, Rửa bằng PBS 1X
- Ly tâm 1000rpm, 5’, cố định bằng PFA 4%
- Ly tâm 1000rpm, 5’, rửa bằng PBS 1X
- Ly tâm 1000rpm, 5’, tạo tính thấm bằng Triton X 0,5%
- Ly tâm 1000rpm, 5’, rửa bằng PBS 1X - Ly tâm 1000rpm, 5’, tăng tính đặc hiệu bằng
BSA 5% Nhuộm kháng thể đối với dòng tế bào bám dính
- Rửa bằng PBS 1X, Rửa với đệm gắn của Annexin V (binding buffer)
- Ủ tế bào với Annexin V (20%) - Tránh ánh sáng - Rửa bằng PBS 1X, nhuộm nhân tế bào bằng PI - Tránh ánh sáng
Nhuộm kháng thể đối với dòng tế bào trôi
- Ly tâm 1000rpm, 5’, rửa bằng PBS 1X - Ly tâm 1000rpm. 5’, rửa bằng đệm gắn của
Annecxin V (binding buffer)
nổi (20%)
- Ly tâm 1000rpm, 5’, rửa bằng PBS 1X - Ly tâm 1000rpm, 5’, nhuộm nhân bằng PI
- Tránh ánh sáng
Gắn
coverslip với TB bám dính
- Rửa bằng PBS 1X, gắn coverslip lên lam kính bằng Glycerol và sơn gắn lamelle
- Tránh ánh sáng
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang
2.3.5. Phƣơng pháp gây u thực nghiệm cho động vật thí nghiệm
Tạo u rắn dưới da cho chuột bằng cách tiêm một triệu tế bào vào dưới da chuột.Cần phân biệt việc tiêm trong da (intradermal injection) và tiêm dưới da (subcutaneous injection).Chúng tơi đã tham khảo hình vẽ (Hình 2.11) hướng dẫn vị trí tiêm để tạo được khối u tại vị trí mong muốn.
Hình 2.11: Hình ảnh cắt dọc cấu trúc da
Minh họa các vị trí và góc tiêm của phương pháp tiêm trong da, dưới da và trong cơ
Chuẩn bị huyền dịch môi trường nuôi cấy và tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma 180, sao cho trong 1ml môi trường có chứa 7,5x106 tế bào, dùng sơranh, kim 18G tiêm 0,2ml huyền dịch tế bào (tương ứng 1,5x106 tế bào) dưới da vùng ngực trái chuột.
Sau khi cấy ghép tế bào để tạo u, tiến hành cân trọng lượng chuột 4 ngày một lần, để khảo sát ảnh hưởng của khối u cũng như tác động của thuốc đến sự phát triển của chuột. Ngoài ra cần chụp ảnh lại khối u định kì thường xuyên để tiến hành đánh giá sau này. Quan sát các biểu hiện, hoạt động, tập tính ăn uống vận động của chuột. Đặc biệt chú ý các biểu hiện như: run rẩy, dựng lơng, ít vận động hoặc các cử
động rối loạn... Sử dụng chương trình excel để xử lý số liệu và vẽ đồ thị biểu diễn sự tăng kích thước của khối u.
2.3.6. Phƣơng pháp thử tác dụng của chế phẩm trên chuột thí nghiệm
Xác định liều chế phẩm thử nghiệm cho chuột:
Để đảm bảo nồng đô ̣ tác du ̣ng của thuốc và đa ̣t được kết quả tối ưu nhất , trong thí nghiê ̣m này chúng tôi dựa vào kết quả đô ̣c tính cấp thu được từ hoa ̣t chất ASP (tiền chất ta ̣o ch ế phẩm sinh học) đã thử nghiê ̣m ở giai đoa ̣n 1 tại Phòng Thử nghiệm Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thử nghiệm. Liều thử nghiê ̣m trên chuô ̣t được cho ̣n tương đương 1/7 của liều thử đô ̣c tính cấp 27,5mg không gây độc cho chuột.Mỗi lần chuột uống 0,2ml dung dịch và đạt đủ nồng độ cần thiết: 1/7 x 27,5= 3,930 (mg/kg TLCT).Chuột nhắt trắng Mus musculus sử dụng trong thí nghiệm có TLCT trung
bình là 20g/con. Như vậy liều cho chuột uống là 0,0786mg/0,2ml/con/lần. Cho
chuột uống 20 lần trong 25 ngày. Tổng lượng chế phẩm thử nghiệm cho một chuột là: 0,0786 x 20 = 1,572mg.
Với thuốc làm đối chứng dương 6-MP (Hình 2.13), liều cho chuột uống được chọn là 1/10 LD50.6-MP cịn có các tên khác là Purinethol, Mercaptopurine … 6-
MP được tổng hợp và phát triển bởi Hitching, Elion tại Phịng thí nghiệm Wellcome Research và có định danh quốc tế là 1,7-dihydro-6H-thione monohydrate.Thuốc này được sử dụng để điều trị nhiều loại ung thư, trong đó đặc trị ung thư mơ liên kết như ung thư máu, các khối u lympho không phải Hodgkin, chứng tăng hồng cầu, viêm khớp vẩy nến và bệnh viêm ruột. 6-MP ức chế quá trình tổng hợp và trao đổi các nucleotide thuộc nhóm purin, làm biến đổi sự tổng hợp và chức năng của ADN và ARN.Thuốc cũng cản trở quá trình chuyển đổi giữa các nucleotide và quá trình tổng hợp glycoprotein.Các thử nghiệm cho thấy khi uống 6-MP thì có một số phản ứng phụ như buồn nôn, biếng ăn, tiêu chảy. Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm của 6-MP là LD50= 480mg/kg trọng lượng cơ thể chuột nhắt khi uống qua đường tiêu hóa[3]. Như vậy, mỗi lần chuột uống 0,2 ml dung dịch chứa nồng độ 6-MP là 48mg/kg TLCT. Chuột thí nghiệm có trọng lượng trung bình 20g nên liều 6-MP cho chuột uống là 0,96mg/0,2ml/con/lần với tổng lượng chế phẩm thử nghiệm cho một chuột là 19,2mg.
Hình 2.12: Thuốc 6MP (Purinethol hay Mercaptopurine)
Xác định sự tăng trọng lƣợng của chuột trong q trình thí nghiệm:
Khi bắt đầu q trình thí nghiệm chuột được cân trọng lượng từng con bằng cân điện tử, tiến hành phân lơ sao cho trọng lượng trung bình của chuột trong mỗi lô là tương đương nhau. Tiến hành cân 4 ngày/lần để xác đ ịnh lại trọng lượng của chuột ở các lơ trong suốt q trình thí nghiệm.
Tiến hành phân lô như sau:
Bảng 2.8: Lô và các thơng số trong q trình thí nghiệm
LƠ LƢỢNG SỐ NGÀY UỐNG LIỀU UỐNG T.GIAN UỐNG
ĐCSH 5 Không thử nghiệm 0
ĐCUT+DM 10 7,8,9,10,11,13,14,15,
16,17,19,20.21,22,23,25,26,27,28,29
0,2ml dung môi
pha thuốc (H2O) 25 ngày
UT+6MP 10 7,8,9,10,11,13,14,15, 16,17,19,20.21,22,23,25,26,27,28,29 0,96mg/0,2ml/lần /con 25 ngày UT+CPSH 10 7,8,9,10,11,13,14,15, 16,17,19,20.21,22,23,25,26,27,28,29 0,0786mg/0,2ml/ lần/con 25 ngày Chuột mang u được thử nghiệm bắt đầu điều trị vào ngày thứ 7 sau cấy ghép,