1.3.1 Phương pháp quang xác định đồng, kẽm
Hiện nay có nhiều phương pháp nhạy và chọn lọc để phân tích hàm lượng đồng và kẽm trong các mẫu sinh học như: phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), phương pháp phổ phát xạ nguyên tử (AES), phương pháp kích hoạt nơtron (NAA), phương pháp phổ khối lượng kết hợp với nguồn cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS), phương pháp chiết trắc quang và phương pháp điện hóa [20, 24, 25,34, 64, 68, 69].
Trong luận văn sử dụng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử AAS và trắc quang để xác định lượng các nguyên tố đồng và kẽm.
1.3.1.1 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử AAS
Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử là phương pháp phổ biến nhất hiện nay để phân tích đồng và kẽm trong các mẫu sinh học, phương pháp này có ưu việt là quá trình xử lý mẫu đơn giản, độ nhạy và độ chọn lọc cao. Các kĩ thuật
nguyên tử hóa thường được sử dụng là kĩ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa và lị graphit. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kĩ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa để phân tích đồng và kẽm trong các mẫu huyết tương [25, 26, 36, 68].
Nguyên tắc của phép đo
Ở điều kiện bình thường ngun tử khơng thu và cũng không phát năng lượng. Nhưng khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái hơi tự do, bị kích thích bằng chùm tia đơn sắc có năng lượng và bước sóng phù hợp, (được tạo bởi một loại đèn riêng cho mỗi nguyên tố kim loại) thì chúng sẽ hấp thụ năng lượng của ánh sáng và sinh ra một loại phổ là phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) của nguyên tố đó [12, 14]. Do đó muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố cần phải thực hiện các quá trình sau:
1. Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do. Đó chính là q trình hố hơi và ngun tử hố mẫu.
2. Chiếu chùm tia bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi nguyên tử tự do vừa tạo ở trên. Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó.
3. Tiếp đó, nhờ một hệ thống máy quang phổ người ta thu toàn bộ chùm sáng, phân ly và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần phân tích để đo cường độ của nó. Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ. Trong một giới hạn nồng độ nhất định của nồng độ C, giá trị cường độ này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nguyên tố ở trong mẫu phân tích.
Theo định luật Buger - Lamber - Beer: khi chùm tia sáng đơn sắc có cường độ Io được chiếu vào mơi trường hấp thụ có độ dài l (cm) chứa No nguyên tử, sau khi ra khỏi mơi trường cịn lại cường độ I, thì cường độ của một vạch phổ hấp thụ là:
Trong đó - D là cường độ hấp thụ của một vạch phổ.
- Kg là hằng số, được gọi là hệ số hấp thụ, phụ thuộc l.
Số nguyên tử No có quan hệ với nồng độ (C) của nguyên tố trong mẫu theo biểu thức :
No = ki .Cb
Với ki là hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào tất cả các điều kiện hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu nhất định đối với một hệ thống máy AAS và với các điều kiện đã chọn cho mỗi phép đo
b: là hằng số bản chất được quyết định bởi bản chất mỗi loại nguyên tử và nồng độ của nó trong mẫu. Trong mọi điều kiện ta đều có.
0 < b ≤ 1 Từ trên suy ra: D = a . Cb (*)
Đây là phương trình cơ sở của phép định lượng các nguyên tố theo phổ hấp thụ nguyên tử. Đường quan hệ D - C theo phương trình (*) có 2 miền ứng với b = 1 và b < 1. Khi b = 1 quan hệ D - C là tuyến tính, trong phân tích người ta sử dụng đoạn này làm đường chuẩn, nồng độ chất nghiên cứu cần nằm trong khoảng này [12, 14].
Trang bị của phép đo
Dựa vào nguyên tắc của phép đo, ta có thể mơ tả hệ thống trang bị của thiết bị đo phổ AAS theo sơ đồ như sau:
Phần 1. Nguồn phát chùm tia bức xạ cộng hưởng của nguyên tố cần phân
tích. Đó có thể là đèn catốt rỗng (Hollow Cathode Lamp-HCL), hay đèn phóng điện khơng điện cực (Electrodeless Discharge Lamp-EDL), hoặc nguồn phát bức xạ liên tục đã được biến điệu.
Phần 2. Hệ thống nguyên tử hoá mẫu. Hệ thống này được chế tạo theo ba
loại kỹ thuật nguyên tử hố mẫu. Đó là:
Kỹ thuật ngun tử hố mẫu bằng ngọn lửa đèn khí (F-AAS).
Kỹ thuật ngun tử hố mẫu khơng ngọn lửa (ETA-AAS).
Kỹ thuật hoá hơi lạnh (CV-AAS).
Phần 3. Bộ phận đơn sắc (hệ quang học) có nhiệm vụ thu, phân ly và chọn
tia sáng (vạch phổ) cần đo hướng vào nhân quang điện để phát hiện và đo tín hiệu hấp thụ AAS của vạch phổ.
Phần 4. Bộ phận khuyếch đại và chỉ thị tín hiệu AAS. Phần chỉ thị tín hiệu
có thể là:
Điện kế chỉ thị tín hiệu AAS.
Bộ tự ghi đề ghi các pic hấp thụ.
Bộ chỉ thị hiện số.
Bộ máy in.
Máy tính với màn hình để hiển thị dữ liệu, phần mềm xử lý số liệu và điều khiển tồn bộ hệ thống máy đo.
Hình 1.4. Sơ đồ nguyên lý của máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử [12]
Trong ba kỹ thuật ngun tử hố mẫu thì kỹ thuật F-AAS ra đời sớm hơn. Theo kỹ thuật này người ta dùng nhiệt ngọn lửa đèn khí để ngun tử hố mẫu. Do đó mọi q trình xảy ra trong khi nguyên tử hoá mẫu đều phụ thuộc vào đặc tính
của ngọn lửa và nhiệt độ là yếu tố quyết định hiệu suất nguyên tử hố mẫu phân tích.
Trong kỹ thuật nguyên tử hố khơng ngọn lửa (ETA-AAS), người ta dùng năng lượng nhiệt của một nguồn năng lượng phù hợp để nung nóng, hố hơi và nguyên tử hố mẫu phân tích trong ống cuvet graphit hay thuyền tantan (Ta). Nguồn năng lượng thường được dùng hiện nay là dịng điện có cường độ cao, từ 50-600A và thế thấp khoảng 12V. Dưới tác dụng của nguồn năng lượng này cuvet chứa mẫu phân tích sẽ được nung nóng đỏ tức khắc và mẫu sẽ được hoá hơi và nguyên tử hoá. Kỹ thuật này có độ nhạy cao, gấp hàng nghìn lần kỹ thuật F-AAS, hơn nữa lượng mẫu tiêu tốn ít, khơng tốn nhiều hố chất. Tuy nhiên, do độ nhạy rất cao nên địi hỏi trong q trình chuẩn bị mẫu phải rất cẩn thận để tránh nhiễm bẩn mẫu [12, 13, 14].
Với kỹ thuật hoá hơi lạnh người ta thường dùng chất khử để chuyển nguyên tố cần phân tích về dạng nguyên tử tự do hoặc dạng hydrua sau đó được dẫn tới cuvet thạch anh bằng khí trơ argon và dùng nhiệt của ngọn lửa để phân huỷ hợp chất đó thành hydro và nguyên tử tự do.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa để xác định đồng và kẽm trong huyết tương.
1.3.1.2 Phương pháp phân tích trắc quang
Phương pháp phân tích trắc quang với các loại thuốc thử định lượng nồng độ đồng và kẽm.
Nguyên tắc chung của phương pháp này là dựa vào khả năng tạo phức màu của các nguyên tố cần xác định với thuốc thử thích hợp và đo độ hấp thụ quang của phức đó. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong các phương pháp phân tích hố lý. Bằng phương pháp này có thể định lượng nhanh chóng.
Phương pháp xác định đồng.
Ở pH = 4,7, đồng phản ứng tạo phức với thuốc thử 3,5-Di-Br-PAESA trong môi trường đệm Acetat 0,2 mol/l. Phức hợp tạo thành được đo ở bước sóng 580nm (570
– 590nm). Khoảng tuy
Phương pháp xác định k
Kẽm phản ứng và t trường mixen trung tính là ch bước sóng 560 nm (550 là 25 – 672 µg/dl.
1.3.2 Phương pháp, c
Có rất nhiều ph máy điện giải chưa đư dụng phương pháp quang k
bu tan (đốt- đo quang) tuy nhiên phương pháp này có nhi dụng hơi đốt nên dễ gây cháy nổ, kh
ra đời hoạt động dựa tr
điện tử sử dụng để đo nồng độ của các chất điện giải nh
Nguyên lý hoạt độ các ion chuyển động tự
ng tuyến tính định lượng của thuốc thử là 35 – 546
nh kẽm:
ng và tạo phức với thuốc thử 5-Br-PAPS ở pH = ng mixen trung tính là chất hoạt động bề mặt Triton X-100. Ph
(550 – 570nm). Khoảng tuyến tính định lượ
háp, cơ sở tính tốn của xét nghiệm điện giả
ất nhiều phương pháp để đo các chất Na+, K+, iCa kể tr ưa được phát triển để đo nồng độ các chất trên ngư
ương pháp quang kế ngọn lửa phát xạ với hơi đốt là axetilen, propan ho đo quang) tuy nhiên phương pháp này có nhiều như
ễ gây cháy nổ, khả năng chính xác khơng cao…). Máy đi ời hoạt động dựa trên ứng dụng của điện cực chọn lọc. Máy đi
ện tử sử dụng để đo nồng độ của các chất điện giải như: Na+, K
Hình 1.5. Điện cực chọn lọc ion[55].
ộng của điện cực chọn lọc ion phụ thuộc vào tương tác gi ự do trong mẫu với vật liệu làm cảm biến (hình
546 µg/dl.
pH = 9,75 trong mơi 100. Phức này hấp thụ ở ợng kẽm của hóa chất
ải
ể trên. Trước đây khi ên người ta thường sử à axetilen, propan hoặc ược điểm (do phải sử năng chính xác khơng cao…). Máy điện giải Máy điện giải là thiết bị
, K+, iCa, …
c vào tương tác giữa n (hình 1.5).
Màng chọn lọc ion có tác dụng ngăn cách giữa dung dịch mẫu và dung dịch chất điện ly, trong đó nồng độ của dung dịch chất điện ly đã biết còn nồng độ của dung dịch mẫu là chưa biết. Màng chọn lọc ion có cấu trúc đặc biệt, nó phản ứng với những chất nằm trong dung dịch chất điện ly mà có mặt trong dung dịch mẫu. Màng hoạt động như một bộ trao đổi ion. Nồng độ dung dịch điện cực là 1 giá trị đã biết, được xác định bởi thế bên này màng chọn lọc ion. Giá trị thế của mẫu ở bên kia màng là một giá trị chưa biết (ta đang cần đo). Để xác định giá trị chênh lệch điện thế giữa bên trong và bên ngoài màng người ta sử dụng một dụng cụ đo điện Galvanic với các điện cực Calomel. Bằng cách sử dụng một dung dịch chuẩn, một đường kết nối điện giữa mẫu và điện cực được thiết lập, thế chuyển tiếp được hình thành tại lớp tiếp giáp giữa mẫu và dung dịch chuẩn. Giá trị của thế chuyển tiếp này được tính tốn dựa trên cơ sở nồng độ của các ion có trong dung dịch chuẩn.
Ngay sau khi mẫu được đo, dung dịch chuẩn có nồng độ ion đã biết được đo để cung cấp giá trị so sánh. Dựa trên cơ sở giá trị mẫu đo và giá trị chuẩn ta có thể tính được nồng độ của mẫu.
Điện cực chọn lọc ion được sử dụng không đo nồng độ ion trực tiếp mà đo độ hoạt động của ion đó. Độ hoạt động của ion biểu thị khả năng tương tác của ion đó với các ion khác. Nồng độ của ion chỉ được tính tốn dựa trên cơ sở giá trị độ hoạt động của ion đo được, mối tương quan này cũng phụ thuộc vào tổng số ion tồn tại trong dung dịch.
Nguyên lý đo của thiết bị xét nghiệm natri, kali, canxi ion[55].
Mẫu máu hoặc nước tiểu cần phân tích được hút, rồi bơm tới một hệ thống ba điện cực nối tiếp nhau: lần lượt các điện cực là điện cực K+, Na+, iCa
Điện cực Na+ là một ống thuỷ tinh, ống này được làm bằng vật liệu có độ nhạy rất cao với ion Na+. Điện cực K+ là một ống nhựa, ống này chứa chất Valinomycin có tác dụng chọn lọc tất cả các ion K+ có trong dung dịch chảy qua nó. Tương tự như vậy ở điện cực iCa cũng có chứa chất nhạy với ion iCa . Thế của mỗi điện cực được so sánh với một thế chuẩn và ổn định được tạo ra bởi điện cực chuẩn
Ag/AgCl.
Để đo được nồng độ của ion trong mẫu bệnh phẩm người ta dùng phương pháp đo tham chiếu. Đầu tiên, máy sẽ đo thế khi mẫu được bơm qua hệ thống các điện cực. Tiếp đến, một dung dịch chuẩn có nồng độ các ion cần đo đã biết được bơm qua các điện cực đó. Độ chênh lệch điện thế giữa hai lần đo được tỷ lệ với nồng độ của ion tương ứng. Do độ chênh lệch điện thế là đo được và nồng độ của ion dung dịch chuẩn là đã biết trước nên máy có thể tính tốn được nồng độ của các ion trong mẫu.
1.3.3 Tình hình nghiên cứu về các nguyên tố vi lượng ở bệnh nhân chạy thận 1.3.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới.
Trên thế giới có một vài nghiên cứu về các nguyên tố vi lượng ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo, tuy nhiên về số lượng chưa được nhiều bệnh nhân nên hầu hết các tác giả đều cần đề cập nghiên cứu thêm về các nguyên tố vi lượng ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo.
Harold và cộng sự nghiên cứu trên 80 bệnh nhân bệnh nhân ure huyết cao và chạy thận tạo về các nguyên tố vi lượng. Kết quả cho thấy các nguyên tố vi lượng giảm ở bệnh nhân chạy thận. Tác giả đề xuất cần có nghiên cứu nhiều hơn để làm sáng tỏ về các nguyên tố vi lượng ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo.
Nghiên cứu của Rajashri.B và cộng sự trên 60 bệnh nhân về ảnh hưởng của chạy thận lên nồng độ đồng và kẽm ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo. Kết quả cho thấy nồng độ đồng, kẽm của bệnh nhân trước lọc máu thấp hơn so với nhóm chứng. Nồng độ đồng, kẽm bị giảm sau khi lọc máu so với trước lọc máu, nồng độ kẽm giảm nhiều hơn nồng độ đồng sau lọc máu. Tác giả cũng kiến nghị cần có thêm nghiên cứu để đánh giá sự mất cân bằng đồng kẽm ở bệnh nhân chạy thận.
Nghiên cứu của Hossein Khalili và cộng sự về bệnh nhân chạy thận nhân tạo bị thêm bệnh thiếu máu, bệnh tuyến giáp và bị ngứa nặng. Đối tượng nghiên cứu là 60 bệnh nhân nam và 34 nữ. Kết quả cho thấy nồng độ kẽm ở bệnh nhân chạy thận thấp hơn nhóm chứng. Tuy nhiên, kết quả cho thấy khơng có mối tương quan giữa
nặng ở những bệnh nhân chạy thận. Tác giả cũng kiến nghị nghiên cứu sâu hơn để tiếp tục nghiên cứu các tình trạng thiếu kẽm và ảnh hưởng của nó ở những bệnh nhân chạy thận.
1.3.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Trên thực tế, tại Việt Nam cho đến nay có rất ít nghiên cứu về ngun tố vi lượng trong huyết thanh. Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân chạy thận nhân tạo thì chưa có nghiên cứu nào cơng bố.
Nghiên cứu của Vũ Đức Lợi và cộng sự nghiên cứu hàm lượng đồng, kẽm ở các bệnh trên 518 bệnh nhân. Kết quả cho thấy hàm lượng đồng tăng dần theo độ tuổi, hàm lượng kẽm giảm dần theo độ tuổi.
Quan các nghiên cứu trên thế giới và nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi thực hiện nghiên cứu các nguyên tố vi lượng ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
Toàn bộ đối tượng nghiên cứu được thu thập từ tháng 6/2015 đến tháng 9/2015 và chia làm 2 nhóm chính
Nhóm 1: Nhóm chứng gồm 38 người khỏe mạnh được lựa chọn từ những người đến khám sức khỏe tại Bệnh viện 19-8, khơng có dấu hiệu của bất kỳ bệnh nào.
Nhóm 2: Nhóm nghiên cứu gồm 100 bệnh nhân đang chạy thận tại khoa Thận Nhân Tạo, Bệnh viện 19-8. Nhóm nghiên cứu được chia làm 2 nhóm: Nhóm bệnh nhân chạy thận nhân tạo với thời gian > 5 năm là 30 người và nhóm bệnh nhân chạy thận nhân tạo với thời gian < 5 năm là 70 người.