2.4.1 Phương pháp xác định đồng, kẽm
Phương pháp trắc quang: Mẫu huyết tương tách ra được đem phân tích ngay, nếu
mẫu huyết tương bảo quản ở -200C thì để rã đơng tự nhiên rồi phân tích. Q trình phân tích được thực hiện theo các bước sau:
Bước 1: Khử protein. Cả đồng và kẽm đều khử protein trước khi phân tích hàm
lượng. Quy trình khử protein như bảng sau:
Bảng 2.1. Quy trình khử protein của đồng và kẽm
Dung dịch Ống trắng Ống chuẩn Ống thử
Nước cất 200µl - -
Dung dịch chuẩn - 200µl -
Bệnh phẩm - - 200µl
Axit tricloacetic 370mmol/l 200µl 200µl 200µl Trộn đều, rồi ly tâm 10 phút ở tốc độ 10000 vòng/phút. Hút dịch trong phía trên để định lượng đồng, kẽm. Dịch trong này phải được định lượng trong vòng 2 giờ.
Bước 2: Xác định hàm lượng đồng và kẽm
- Định lượng nồng độ đồng:
Pha thuốc thử 1 theo tỉ lệ 1 thể tích R1a với 1 thể tích R1b, trộn đều. Cài đặt chương trình đo lên máy sinh hóa AU680 như bảng sau:
Bảng 2.2. Chương trình định lượng nồng độ đồng trên máy sinh hóa AU680
Thông số máy Cài đặt Thông số máy Cài đặt
Tên xét nghiệm Copper Loại bệnh phẩm Plasma
Bệnh phẩm 25 µL Pha lỗng 10 µL
Thuốc thử 1 75 µL Pha loãng 10 µL Thuốc thử 2 32 µL Pha lỗng 0 µL Bước sóng chính 570 nm Bước sóng phụ 660 nm Phương pháp ENDPOINT Chiều phản ứng +
Điểm đo 1 10 Điểm đo 2 27
Khoảng đo 35 – 546 µg/dL Đồ thị Y = Ax + B Nồng độ chuẩn 197 µg/dL Độ lặp lại 2
Nồng độ QC1 39 ± 3,0 µg/dL Nồng độ QC2 148 ± 6,1 µg/dL Lập đường chuẩn: Cho dịch trong của ống trắng ở trên vào cốc chứa mẫu, đặt vào khay chuyển mẫu trắng (Rack blank). Cho dung dịch trong chuẩn ở trên vào cốc chứa mẫu và đặt lên vị trí đã chon trên khay chuyển mẫu (Rack Calibration). Cho máy chạy, sau khi chạy xong ta có đường chuẩn. Hàm lượng đồng sẽ được tính theo đường chuẩn.
Sau khi có đường chuẩn ta dùng QC của chính hãng hóa chất Randox (Randox Assayed Multi-sera Control Level 1&2) để kiểm tra lại, nếu QC đạt trong giới hạn cho phép thì ta đo mẫu huyết tương.
Khi định lượng nồng độ đồng bằng phương pháp trắc quang cho thấy độ lặp lại của QC và mẫu bệnh phẩm không ổn định nên tất cả đồng đều chuyển sang phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử.
Định lượng nồng độ kẽm:
Pha thuốc thử 1a và thuốc thử 1b theo tỉ lệ 4:1, lắc đều. (Thuốc thử 1). Cài đặt chương trình đo lên máy sinh hóa AU680 như bảng sau:
Bảng 2.3. Chương trình định lượng nồng độ kẽm trên máy sinh hóa AU680
Thơng số máy Cài đặt Thông số máy Cài đặt
Tên xét nghiệm Zinc Loại bệnh phẩm Plasma
Bệnh phẩm 30 µL Pha lỗng 0 µL
Thuốc thử 1 120 µL Pha lỗng 10 µL
Thuốc thử 2 0 µL Pha lỗng 0 µL
Bước sóng chính 570 nm Bước sóng phụ 660 nm Phương pháp ENDPOINT Chiều phản ứng +
Điểm đo 1 10 Điểm đo 2 27
Khoảng đo 25 – 672 µg/dL Đồ thị Y = Ax + B Nồng độ chuẩn 200 µg/dL Độ lặp lại 2
Nồng độ QC1 50 ± 3,2 µg/dL Nồng độ QC2 256 ± 8,3 µg/dL Lập đường chuẩn: Cho dịch trong của ống trắng ở trên vào cốc chứa mẫu, đặt vào khay chuyển mẫu trắng (Rack blank). Cho dung dịch trong chuẩn của kẽm ở trên vào cốc chứa mẫu và đặt lên vị trí đã chon trên khay chuyển mẫu (Rack Calibration). Cho máy chạy, sau khi chạy xong ta có đường chuẩn. Hàm lượng kẽm sẽ được tính dựa theo đường chuẩn
Sau khi có đường chuẩn ta dùng QC của hãng Randox (Randox Assayed Multi-sera Control Level 1&2) để kiểm tra lại, nếu QC đạt trong giới hạn cho phép thì ta đo mẫu huyết tương.
Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
Chuẩn bị mẫu: Mẫu huyết tương được bảo quản trong lạnh, khi tiến hành
phân tích được rã đơng tự nhiên, sau đó mẫu được pha lỗng với nước cất theo tỷ lệ 1:1. Hàm lượng đồng và kẽm trong huyết tương được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật ngọn lửa.
Các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Cu và Zn
Các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng và kẽm trên thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-3300 Perkin-Elmer được đưa ra ở bảng sau:
Bảng 2.4. Các thông số đo phổ của đồng và kẽm
Thông số máy Nguyên tố đồng Nguyên tố kẽm
Nguồn sáng Đèn catốt rỗng (HCL) Đèn catốt rỗng (HCL)
Bước sóng 324,8 nm 213,9 nm
Độ rộng khe đo 0,7 nm 0,7 nm
Cường độ dòng đèn catốt
rỗng 20 mA 14 mA
Thời gian đo 5 giây 5 giây
Thể tích mẫu đo (ml) 0,3 ml 0,3 ml
Số lần đo lặp lại 3 3
Kỹ thuật nguyên tử hoá Ngọn lửa Ngọn lửa
Khí tạo ngọn lửa Khơng khí nén/ Axetylen Khơng khí nén/ Axetylen
Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ đồng và kẽm lần lượt là : 0; 0,2; 0,4; 0,6; 1; 1,2; 1,5mg/l trong nền Glyxerin 10%, NaCl (28 mmol/l), KCl (1mmol/l) và CaCl2 (0,5 mmol/l) là dung dịch nền có thành phần tương tự huyết tương. Sau đó tiến hành đo độ hấp thụ nguyên tử của đồng và theo các điều kiện tối ưu đã lựa chọn. Hàm lượng đồng và kẽm trong mẫu được tính tốn dựa theo đường chuẩn.
Độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua việc phân tích mẫu huyết thanh chuẩn NIST SMR 1598 (Inorganic Constituents in Bovine Serum).
Quy trình phân tích đồng và kẽm trong huyết tương bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử được mô tả theo sơ đồ sau:
Mẫu máu
Ly tâm
Huyết Tương
Pha loãng với nước cất (Tỉ lệ 1:1)
Dung dịch phân tích
Đo trên máy AAS-3300 của hãng Perkin-Elmer.
Hình 2.1. Quy trình phân tích hàm lượng đồng và kẽm trong huyết tương
2.4.2 Phương pháp định lượng Na+, K+, iCa
Na+, K+, iCa trong huyết tương được đo trên máy điện giải Ilyte của Mỹ sản xuất bằng phương pháp điện cực chọn lọc, mỗi nguyên tố sử dụng một điện cực riêng với chất làm điện cực khác nhau, điện cực Na+ là một ống thuỷ tinh, có độ nhạy rất cao với ion Na+. Điện cực K+ là một ống nhựa, ống này chứa chất Valinomycin có tác dụng chọn lọc tất cả các ion K+ có trong dung dịch. Điện cực iCa cũng có chứa chất nhạy với ion iCa. Điện thế của mỗi điện cực được so sánh với một điện thế chuẩn và ổn định được tạo ra bởi điện cực chuẩn Ag/AgCl.
Điện thế của dung dịch chuẩn được đo dựa trên nồng độ của các ion có trong dung dịch chuẩn, sau đó đo nồng độ các ion có trong mẫu phẩm. Độ chênh lệch điện thế giữa dung dịch chuẩn và mẫu phẩm đo được tỷ lệ với nồng độ của ion tương ứng, nồng độ của ion dung dịch chuẩn là đã biết trước nên tính tốn được nồng độ của các ion trong mẫu.
2.4.3 Phương pháp định lượng các chỉ số hóa sinh
Định lượng ure, creatinin bằng phương pháp trắc quang trên máy AU680 sử dụng bộ hóa chất của hãng Beckman với chương trình được thiết lập để thực hiện xét nghiệm thường qui hằng ngày cho bệnh nhân.