1.1 .TỤ CẦU KHUẨN
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU
Để phát hiện SE trong thực phẩm, có thể sử dụng phép thử sinh học, phƣơng pháp sinh học phân tử hoặc các phƣơng pháp miễn dịch.
1.3.1. Phép thử sinh học
Nguyên tắc của các phép thử sinh học dựa trên việc phân tích khả năng gây các triệu chứng điển hình nhƣ nơn , tiêu chảy trên các động vật thí nghiệm hoặc hoạt động siêu kháng nguyên trong nuôi cấy tế bào . Thông thƣờng, các SE sẽ đƣợc tách chiết từ thƣ̣c phẩm bằng các dung dịch đệm thích hợp , trải qua bƣớc tinh chế bằng phƣơng pháp sắc ký, sau đó cho dịch chiết độc tố này vào dạ dày động vật hoặc tiêm vào màng bụng: cho vào dạ dày khỉ bằng đƣờng ống thông , cho chuột chù nhà và mèo uống hoặc tiêm vào màng bụng chúng [48, 100]. Tiếp theo, tiến hành theo dõi các triê ̣u chƣ́ng lâm sàng của động vật thí nghiệm. Nếu thấy xuất hiện các biểu hiện điển hình nhƣ tiêu chảy, nôn thì có thể kết luâ ̣n là thƣ̣c phẩm bi ̣ nhiễm các SE . Tuy nhiên, liều lƣợng SE tối thiểu cần sử dụng trong các phép thử sinh học là khoảng 200 ng [104], cao hơn nhiều so với liều gây ngộ độc thực phẩm ở ngƣời (20 – 100ng) [51]. Vì vậy, phƣơng pháp phát hiện độc tố tụ cầu bằng phép thử sinh học không đủ nhạy để kiểm nghiệm thực phẩm đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng. Ngồi ra, vì lý do đạo đức sinh họ c, hiện nay việc sử dụng các động vật để thí nghiệm đang bị hạn chế.
1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
Các phƣơng pháp sinh học phân tử thƣờng sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện các gen mã hóa các độc tố SE trong thực phẩm dựa trên các trình tự mồi chuyên biệt cho các gen mã hóa độc tố SE. Các phản ứng PCR thƣờng dùng là uniplex và multiplex PCR và gần đây là real-time PCR [25, 12, 110]. Các phƣơng pháp này có ƣu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, cho phép phát hiện nhanh Staphylococcus tạo độc tố với một lƣợng mẫu nhỏ. Hơn nữa, có thể phát hiện đƣợc cả những tế bào sinh độc tố đã chết, điều này rất quan trọng trong việc phân tích các mẫu thực phẩm đã xử lí nhiệt liên quan đến những vụ ngộ độc thực phẩm. Tuy nhiên, hạn chế cơ bản của loại phƣơng pháp này là nó chỉ cho biết sự có mặt hay khơng của các gen mã hóa SE
trong thực phẩm mà khơng cho biết sự biểu hiện của các gen này.
1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch
Hiện nay, phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất để phát hiện SE trong thực phẩm là các phƣơng pháp miễn dịch , nhờ tƣơng tác đă ̣c hiê ̣u giƣ̃a kháng nguyên và kháng thể.
1.3.3.1. Phương pháp khuếch tán trên gel (Microslide Double Diffusion )
Phƣơng pháp khuếch tán trên gel dựa vào các tƣơng tác đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể là phƣơng pháp đầu tiên trong phịng thí nghiệm có thể xác định các SE. Từ những năm 1950, các phƣơng pháp khuếch tán trên gel đƣợc phát triển nhƣ phƣơng pháp khuếch tán trên gel đơn [80], phƣơng pháp ống khuếch tán gel khép [75], phƣơng pháp đĩa [79] và phƣơng pháp khuếch tán trên gel microslide [29]. Phƣơng pháp microslide là phƣơng pháp nhạy nhất trong các phƣơng pháp khuếch tán trên gel. Áp dụng kỹ thuật khuếch tán trên gel microslide để phát hiện các SE cần nồng độ độc tố tối thiểu là 30-60 ng SE trong mỗi gam thực phẩm [90]. Do đó, tinh sạch bằng sắc ký và cơ đặc mẫu phân tích đƣợc áp dụng để đạt đƣợc nồng độ SE có thể phát hiện đƣợc bởi kỹ thuật này. Phƣơng pháp khuếch tán trên gel đƣợc Hiệp hội các nhà phân tích (Asssociation of Analytical Communities - AOAC) coi là tiêu chuẩn cho việc đánh giá các phƣơng pháp mới [90]. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là ít nhạy khi lƣợng độc tố cần phát hiện ở mức tối thiểu và đòi hỏi ngƣời đọc kết quả phải có kinh nghiệm.
1.3.3.2. Phương pháp miễn dịch phóng xạ - RIA (Radio Immunoassay)
Kĩ thuật miễn dịch phát phóng xạ (RIA) là phƣơng pháp đầu tiên có độ nhạy cao (0,6 – 6 ng kháng thể/ml) đƣợc sử dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm. Trong phƣơng pháp này, độc tố đƣợc đánh dấu bằng 125I [91]. Dịch chiết thực phẩm đƣợc cho vào cùng với kháng thể chuyên biệt trong một ống nhựa nhỏ trƣớc khi thêm độc tố đƣợc đánh dấu. Sau đó, xác định lƣợng độc tố trong dịch chiết thực phẩm bằng cách đo tính phóng xạ của chất kết tủa [103, 91]. Hiện nay, phƣơng pháp này không cịn đƣợc sử dụng nữa vì đã có những phƣơng pháp mới hơn khơng cần dùng những vật liệu có tính phóng xạ.
1.3.3.3. Ngưng kết hạt latex (Reversed Passive Latex Aggulutination - RPLA)
Kỹ thuật ngƣng kết hạt latex (RPLA) đƣợc ứng dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm cũng nhƣ phát hiện độc tố trong những dòng tụ cầu. Trong kỹ thuật này, hạt nhựa đƣợc phủ kháng thể của độc tố trƣớc khi cho vào giếng [87]. Dịch chiết mẫ u thực phẩm đƣợc cho vào giếng để tạo phản ứng. Nếu có độc tố trong mẫu thì phản ứng giữa độc tố và kháng thể sẽ tạo ra sự ngƣng kết, màng đƣợc tạo thành dƣới đáy giếng, còn nếu khơng có độc tố thì khơng xảy ra ngƣng kết, do đó phản ứng tạo thành giọt ở đáy giếng. Lƣợng độc tố đƣợc xác định nhờ xác định hiệu giá kháng thể cao nhất mà ở đó cịn xảy ra phản ứng ngƣng kết. Kỹ thuật này đủ nhạy để phát hiện độc tố trong hầu hết thực phẩm của các vụ ngộ độc, cũng nhƣ trong việc phát hiện những dòng tụ cầu tạo ra lƣợng độc tố thấp (10-20 ng/ml) mà phƣơng pháp khuếch tán trên gel không phát hiện đƣợc. Bộ kit thƣơng mại SET-RPLA của công ty Denka Seiken, Tokyo, Nhật Bản đang đƣợc bán tại Mỹ phát hiện đƣợc các SE SEA, SEB, SEC và SED [44].
1.3.3.4. Các phương pháp dựa trên kỹ thuật ELISA
Nguyên lý của phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ gắn enzym (ELISA) là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể vốn đƣợc cố định trên một phiến nhựa (giá đỡ pha rắn) và việc sử dụng phản ứng enzym - cơ chất sẽ gây chuyển màu, qua đó để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể cần phát hiện.
Trên thị trƣờng thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện các SE trong thực phẩm (RIDASCREEN, TECRA, TRANSIA và VIDAS). Nguyên tắc hoạt động của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA kẹp đôi. Đầu tiên, mô ̣t kháng thể đă ̣c hiê ̣ u nhâ ̣n biết SE sẽ đƣợc cố đi ̣nh lên bề mă ̣t của mô ̣t giếng nhƣ̣a. Sau quá trình rƣ̉a để loa ̣i bỏ các kháng thể khơng đƣợc cớ đi ̣nh , mẫu phân tích sẽ đƣợc đƣa vào giếng. Nếu nhƣ trong mẫu phân tích có SE , khi đó sẽ xảy ra phản ứng giữa SE với kháng thể cố định ở giếng , tạo phức hợp kháng thể cố định - SE. Sau q trình rửa để loại bỏ các liên kết khơng đặc hiệu , mô ̣t kháng thể thƣ́ hai gắn enzym và cũng có khả năng nhận biết đặc hiệu SE đƣợc đƣa vào giếng để ta ̣o ra mô ̣t phƣ́c hợp mới kháng thể cố đi ̣nh - SE - kháng thể gắn enzym. Tiếp đó, lại thực hiện quá trình rửa để loại bỏ phân tử kháng thể gắn enzym dƣ cịn sót lại trong giếng . Ći cùng, cơ chất của en zym đƣơ ̣c đƣa vào giếng . Dƣới tác du ̣ng của enzym , cơ chất sẽ chuyển hóa
thành sản phẩm có màu . Nhƣ vâ ̣y, dƣ̣a vào viê ̣c xuất hiê ̣n màu có thể phát hiê ̣n đƣợc SE trong mẫu phân tích . Đối với một số bộ sinh phẩm , cƣờng đô ̣ màu sẽ tỷ lệ thuận với nồng đô ̣ SE trong mẫu phân tích . Do vâ ̣y, bằng cách lâ ̣p đƣờng chuẩn , có thể định lƣơ ̣ng đƣợc SE trong thƣ̣c phẩm . Dƣới đây là các bộ sinh phẩm thƣơng mại trên thị trƣờng thế giới đang dùng để phát hiện các SE.
Bảng 1.4. Các bộ sinh phẩm thương mại được sử dụng để phát hiện các SE [97]
Tên bộ sinh phẩm Nguyên lý phân tích Độ nhạy(ng/ml) Thời gian phân tích (giờ) Nhà sản xuất Ridasreen SET A, B, C, D, E3 ELISA kẹp đôi dùng các đĩa vi giếng chuẩn 0,2-0,7 2,5 R-Biopharm Staphylococcal Enterotoxin (SET) Identification TECRA3
ELISA kẹp đôi
dùng đĩa vi giếng 1 4
Bioenterprises
Staphylococcal Enterotoxin (SET A-E) TECRA
ELISA kẹp đôi trong các đĩa vi giếng chuẩn
1 4 Bioenterprises
Transia Tube Staphylococcal Enterotoxins A, B, C, D, E
ELISA kẹp đôi dùng các ống nhƣ pha rắn
0,1 1 Diffchamb
Transia Plate Staphylococcal Enterotoxins A, B, C, D, E
ELISA kẹp đôi trong các đĩa vi giếng chuẩn
0,1 2 Diffchamb
Vidas Staph enterotoxin (SET)
ELISA kẹp đôi tự
động 1 1,5 BioMérieux
Tồn bộ quy trình phân tích để phát hiện các SE thƣờng kéo dài từ 1 đến 4 giờ tùy theo bộ sinh phẩm . Ngƣỡng phát hiện của các bộ sinh phẩm này thƣờng dao động
từ 0,1-1 ng/ml dịch mẫu phân tích, cho phép phát hiện đƣợc SE ở nồng độ rất thấp [60]. Tuy nhiên , nhƣợc điểm cơ bản của các bộ sinh phẩm này là cần một máy đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết quả , đờng thời, các bộ sinh phẩm này cũng cần các kỹ thuật viên có tay nghề cao khi sử dụng để tránh hiện tƣợng dƣơng tính giả nên yêu cầu này hạn chế đáng kể khả năng phân tích tại hiện trƣờng của các bộ sinh phẩm. Để đáp ứng nhu cầu phát hiện các SE trong các thực phẩm tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh SE. Dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật ELISA, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Đỗ Phúc đã chế tạo kháng thể đa dòng kháng độc tố SEA từ thỏ và sử dụng kháng thể này để chế tạo bộ sinh phẩm ELISA nhằm phát hiện SEA trong thực phẩm [8]. Khi so sánh với bộ sinh phẩm chuẩn của hãng TECRA, quy trình ELISA này cho độ tƣơng đồng về mặt kết quả là 95,5%. Năm 2008, Nguyễn Hoàng Minh và nhóm nghiên cƣ́u đã phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật ELISA kẹp đôi để phát hiện SEA trong các sản phẩm thịt và sữa. Về độ đặc hiệu, bộ sinh phẩm đã đƣợc chứng minh là khơng có các phản ứng chéo với các loại độc tố khác nhƣ SEB, SEC1, SED và SEE. Về độ nhạy, bộ sinh phẩm có thể phát hiện đƣợc SEA với ngƣỡng xác định khoảng 1 ng/ml sữa tiệt trùng, tƣơng đƣơng với các bộ sinh phẩm hiện đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng [5]. Một ƣu điểm nổi bật khác của bộ sinh phẩm này là kết quả có thể đƣợc phân tích bằng mắt thƣờng , khơng cần sử dụng các máy đọc ELISA chuyên dụng , nên có thể đƣợc ứng dụng tại hiện trƣờng. Năm 2011, các bộ sinh phẩm này đã đƣợc sản xuất thử nghiê ̣m ở quy mơ phịng thí nghiệm và thƣ̉ nghiê ̣m liên phòng ta ̣i ba phòng thí nghiê ̣m khác nhau . Các kết quả thƣ̉ nghiê ̣m cho thấy đối với mẫu nem chua , đô ̣ nha ̣y và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u tƣơng đối của bộ sinh phẩm đều đạt 100%, trong khi đó với các mẫu sƣ̃a tiê ̣t trùng có độ nhạy 100%, cịn độ đặc hiệu là 83,3%. Các kết quả thử nghiệm bƣớc đầu này cho thấy tính chính xác của bộ sinh phẩm ELISA trong điều kiện phân tích tại hiện trƣờng là phụ thuộc vào kỹ thuật viên và chất nền (sữa hay nem chua).