KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU SEC1 TÁI TỔ HỢP
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ S. aureus
Hình ảnh điện di kiểm tra kích thƣớc DNA tổng số của chủng S. aureus P240 (Hình 3.1) cho thấy có 1 băng sáng rõ có kích thƣớc lớn ở trên cao, đó chính là DNA tổng số của S. aureus. Ngoài ra, bên dƣới xuất hiện một dải băng sáng mờ hơn DNA tổng số có thể là DNA plasmid, RNA có kích thƣớc nhỏ, những hợp phần này đã chạy nhanh hơn so với các DNA tổng số nên nằm ở phía dƣới. Nhƣ vậy, quy trình tách chiết đã thu đƣợc sản phẩm DNA đạt chất lƣợng để sử dụng làm khn trong phản ứng PCR khuếch đại gen sec1.
Hình 3.1. Điện di đồ DNA tổng số tách từ S. aureus
3.1.2. Khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR
Qua nghiên cứu bản đồ cắt hạn chế của gen sec1, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pGS-21a, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym giới hạn BamHI và HindIII (các enzym có trong trình tự đoạn polylinker của vector pGS-21a) khơng có trong trình tự gen sec1 của S. aureus. Do đó, trình tự điểm cắt của 2 enzym BamHI và HindIII
đƣợc bổ sung lần lƣợt vào đầu 5’ của cặp mồi xi và mồi ngƣợc tƣơng ứng. Trình tự mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen sec1 với các thông số đƣợc thể hiện nhƣ sau: Mồi xuôi SEC-F (5'-TTTGGATCCGAGAGCCAACCAGACCCT-3') và mồi ngƣợc SEC-R (5'- TATAAGCTTTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGGAC-3'), chữ đƣợc gạch chân là trình tự nhận biết của enzym giới hạn. Các đoạn mồi này đƣợc dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1 từ DNA tổng số và phản ứng PCR sàng lọc những chủng đƣợc biến nạp thành công.
Từ cơ sở nguồn DNA tổng số tách từ S. aureus, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%, kết quả thể hiện ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1, 2%
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: đoạn gen sec1
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose (Hình 3.2) cho thấy với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đã thu đƣợc sản phẩm PCR duy nhất, rõ nét, có kích thƣớc khoảng 800 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi (kích thƣớc của gen sec1 là 801 bp). Nhƣ vậy, đoạn DNA mang gen mã hóa protein SEC1 đã đƣợc khuyếch đại
đặc hiệu. Kết quả này chứng tỏ chƣơng trình và cặp mồi khuếch đại gen mã hóa cho protein SEC1 đã đƣợc thiết kế hợp lý về mặt lý thuyết và kỹ thuật. Sản phẩm PCR này đƣợc sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Xây dựng vector biểu hiện pGS-21a mang gen sec1
* Cắt đoạn gen sec1 bằng các enzym giới hạn
Sản phẩm của phản ứng PCR sau khi tinh sạch đƣợc cắt bằng enzym giới hạn
BamHI và HindIII, kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose 1.2%. Kết quả
kiểm tra sản phẩm tinh sạch đƣợc thể hiện trên điện di đồ (Hình 3.3) chỉ xuất hiện một băng duy nhất có kích thƣớc trong khoảng 800 bp, tƣơng đƣơng kích thƣớc của gen
sec1, khơng có sản phẩm phụ, đo đó có thể làm nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu
hiện.
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm gen sec1 sau tinh sạch
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: đoạn gen sec1 sau tinh sạch * Cắt plasmid pGS-21a bằng enzym giới hạn
Chúng tôi tiến hành cắt mở vòng plasmid pGS-21a bằng hai enzym giới hạn
Hình 3.4. Điện di đồ plasmid pGS-21a sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1: plasmid pGS-21a sau cắt chưa tinh sạch, 2: plasmid pGS-21a sau cắt đã tinh sạch.
Kết quả điện di ở Hình 3.4 cho thấy plasmid pGS-21a sau cắt đã tinh sạch đạt yêu cầu để sử dụng biến nạp, là một băng duy nhất có kích thƣớc gần tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pGS-21a (6169 bp) nhƣ trong lý thuyết.
* Nối đoạn gen sec1 vào vector pGS-21a
Đoạn gen sec1 sau khi cắt bằng enzym giới hạn đƣợc nối vào vector pGS-21a bởi xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối là plasmid pGS-21a - sec1 sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21.
Nhờ đặc tính của các enzyme cắt giới hạn có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu nên chúng đƣợc sử dụng cho quá trình cắt và nối với gen sec1 và vector pGS-21a, tạo đầu dính phù hợp cho đoạn gen thu đƣợc sau khi tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR, tạo liên kết đầu dính phù hợp với vector biểu hiện pGS-21a. Tính bổ sung giữa những phần nhơ ra (overhang) và các trình tự bổ sung cho phép gen sec1 có thể hịa nhập với vector thành vector tái tổ hợp một cách dễ dàng dƣới tác dụng của enzym T4 DNA ligase.
Plasmid pGS-21a đƣơ ̣c thiết kế để làm vectơ biểu hiê ̣n protein tá i tổ hợp trong
Escherichia coli, với promoter T7 đƣợc cảm ƣ́ng bởi IPTG để tổng hợp protein SEC1 có hiệu suất cao, có chứa gen kháng ampicilline làm gen chỉ thị, chọn lọc. Trên plasmid này có các trình tự mã hóa, cho phép ta ̣o ra độc tố SEC1 tái tổ hợp có dạng dung hợp đi GST- His dễ
3.1.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEC1 tái tổ hợp
Biến nạp plasmid mang gen mã hóa SEC1 vào E. coli BL21
Plasmid pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu SEC1 đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sau đó, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên mơi trƣờng LB có ampicillin. Trên mơi trƣờng thạch LB, ứng với mẫu E. coli đã đƣợc biến nạp thấy xuất hiện khoảng 50 khuẩn lạc. Trong khi đó, ở mẫu E. coli chƣa đƣợc biến nạp, không thấy xuất hiện khuẩn lạc nào. Tất cả các khuẩn lạc trên là những khuẩn lạc đƣợc biến nạp chứa gen kháng ampicillin và số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc cũng đủ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony - PCR
Phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu sec1, với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và
SEC-R đƣợc sử dụng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen sec1 trong plasmid tái tổ hợp ở các dịng khuẩn lạc trên đĩa ni cấy. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra, kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.5.
Hình 3.5 Điện di đồ sàng lọc khuẩn lạc mang pGS-21a-sec1 bằng colony PCR
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1-5: sản phẩm PCR từ DNA của các mẫu khuẩn lạc thu được; (-): đối chứng âm.
Kết quả thu đƣợc trên Hình 3.5 cho thấy ở các giếng 1-5 đều xuất hiện 1 vạch sáng, rõ nét ở vị trí khoảng 800 tƣơng ứng với kích thƣớc của đoạn gen sec1 (801 bp). Nhƣ vậy, việc biến nạp plasmid tái tổ hợp pGS-21a-sec1 vào trong tế bào E. coli BL21 đã
Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng giải trình tự gen
Do các đột biến có thể phát sinh trong q trình thiết kế vector nên những khuẩn lạc đã xác định có đoạn gen sec1 đƣợc lựa chọn để tách chiết plasmid, các plasmid
mang gen sec1 đƣợc giải trình tự và đối chiếu với trình tự trên GeneBank của NCBI.
Những plasmid khơng mang bất cứ đột biến nào đƣợc lựa chọn để biểu hiện protein SEC1.
Hình 3.6. Hình ảnh giải trình tự gen của đoạn gen biến nạp sec1
Kết quả giải trình tự của đoạn gen sec1 (hình 3.6) cho thấy các đỉnh rõ nét và tƣơng đối đồng đều. So sánh với trình tự GeneBank có độ tƣơng đồng là 100%.
Gen sec1 trong vector biểu hiện hoạt động dƣới sự điều khiển của T7 lac promoter và đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) có trong mơi trƣờng. Để nghiên cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công đƣợc nuôi cấy trong mơi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin, lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,6 thì bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và nuôi tiếp ở 30o C trong 5 giờ. Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã đƣợc phân tích trên gel polacrylamide.
Hình 3.7. Điện di đồ so sánh protein tổng số của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp
M: thang protein chuẩn; 1: Đối chứng âm (protein tan tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli BL21); 2: Protein tan trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS-
21a-sec1 được cảm ứng IPTG.
Kết quả kiểm tra protein tổng số của dòng tế bào mang pGS-21a-sec1 và dịng đối chứng đƣợc trình bày ở Hình 3.7 cho thấy sự xuất hiện của một băng protein với cƣờng độ đậm, có trọng lƣợng phân tử trong khoảng từ 42,7– 66,2 kDa khi so sánh với thang protein chuẩn, kết quả này phù hợp với protein mà chúng tôi mong đợi, cụ thể là: SEC1 trong trạng thái dung hợp với đuôi GST và 1 vùng đuôi His (6 axit amin Histidin) có khối lƣợng là 57 kDa (SEC1 có khối lƣợng khoảng 28 kDa, đi His – GST có khối lƣợng khoảng 29 kDa). Điều này chỉ ra rằng protein tái tổ hợp đƣợc tạo ra có kích thƣớc hồn tồn phù hợp với các
3.1.5. Xác định các điều kiện biểu hiện gen sec1 thích hợp trong E. coli
Để thu đƣợc lƣợng SEC1 nhiều và có hoạt tính sinh học cao, các điều kiện nuôi tế bào
E. coli chuyển gen nhƣ nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng và thời gian cảm ứng đƣợc tiến hành
khảo sát nhằm chọn điều kiện thích hợp cho biểu hiện protein SEC1 tái tổ hợp.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hƣởng hàng đầu đến sinh tổng hợp và chất lƣợng protein tái tổ hợp. Nhiệt độ càng cao thì lƣợng mARN càng dễ bị phá hủy và khả năng đào thải plasmid càng lớn. Trạng thái tồn tại của protein tái tổ hợp là một trong những điều kiện rất quan trọng cho việc ứng dụng. Thông thƣờng, các protein tồn tại ở dạng hòa tan sẽ giữ đƣợc hoạt tính sinh học và tính sinh miễn dịch cao do không bị biến đổi cấu trúc trong quá trình tinh chế và thu nhận protein. Ngƣợc lại, đối với nhiều loại protein khi đƣợc biểu hiện quá mạnh trong tế bào, thì các protein khác vốn giúp hình thành cấu trúc đúng của protein tái tổ hợp khơng đáp ứng đủ, dẫn đến hình thành cấu trúc bậc ba sai lệch, protein tạo ra khơng có hoạt tính sinh học. Theo lý thuyết, protein đƣợc biểu hiện dƣới dạng khơng tan thƣờng có cấu trúc sai lệch. Vì vậy cần phải lựa chọn đƣợc nhiệt độ thích hợp để thu nhận đƣợc tối đa lƣợng protein tái tổ hợp có hoạt tính sinh học.
Nhiệt độ thích hợp để ni cấy E. coli BL 21 nhằm biểu hiện protein ngoại lai là từ 16oC đến 37oC, theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEC1 tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 30oC và 37oC với nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM IPTG và thu mẫu sau 5 giờ. Lƣợng tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc chuẩn về cùng một OD600 là 10 để so sánh protein tổng số giữa các mẫu nuôi cấy cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau. Dịch chiết thu đƣợc sau khi phá tế bào đƣợc kiểm tra bằng điê ̣n di trên gel acrylamide 12,5%.
Hình 3.8. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các nhiệt độ khác nhau
M: thang protein chuẩn; 1: Protein tan tổng số ở 37oC; 2: Protein tan tổng số ở 30oC.
Kết quả trên hình 3.8 cho thấy ở giếng số 2 xuất hiện băng protein SEC1 đậm hơn so với ở giếng số 1, điều đó chứng tỏ hàm lƣợng protein SEC1 dạng hòa tan trong điều kiện nhiệt độ 30oC nhiều hơn so với ở điều kiện 37oC. Vì vậy, nhiệt độ 30oC đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG
Chất cảm ứng IPTG đƣợc sử dụng nhƣ một yếu tố trung hòa chất ức chế. Tuy nhiên, IPTG ở nồng độ cao có thể gây độc cho tế bào và ức chế tế bào sinh trƣởng. Vì vậy, khi thêm IPTG vào q trình ni cấy chỉ nên cho lƣợng vừa đủ để trung hịa chất ức chế mà khơng gây ảnh hƣởng cho sự sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng của tế bào. Bên cạnh đó, do IPTG có giá thành cao nên việc xác định nồng độ IPTG thích hợp nhất cho nghiên cứu cũng có giá trị thiết thực khi áp dụng sản xuất độc tố ở quy mơ lớn.
Hình 3.9. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các điều kiện IPTG khác nhau
1-7: Protein tan tổng số trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS-21a- sec1 được cảm ứng ở các nồng độ IPTG lần lượt là 1mM; 0,9 mM; 0,7mM; 0,5mM; 0,3mM; 0,1mM; 0,05mM, 8: chứng âm (protein tan tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc E. coli BL21 không bổ sung IPTG), 9: thang protein chuẩn.
Kết quả kiểm tra lƣợng protein tái tổ hợp đƣợc tổng hợp khi chủng E. coli
mang gen sec1 đƣợc cảm ứng ở 0,05 - 1mM IPTG (Hình 3.9) cho thấy sản lƣợng protein SEC1 không bị ảnh hƣởng nhiều bởi các nồng độ chất cảm ứng đã đƣợc thí nghiệm, ít có sự sai khác về sản lƣợng protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, tại các nồng độ khác nhau của chất cảm ứng thì sự biểu hiện của nồng độ protein vẫn có sự khác nhau: ở nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM đến 1mM thì nồng độ protein biểu hiện là cao hơn so với 3 nồng độ 0,05 mM; 0,1 mM và 0,3 mM. Vì thế để thu đƣợc sản lƣợng protein tái tổ hợp cao nhất mà vẫn tiết kiệm đƣợc lƣợng IPTG cần sử dụng, chúng tôi chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG cho chủng mang gen sec1 là 0,5 mM (giếng 4).
Xác định thời điểm thích hợp để thu sản phẩm biểu hiện
Protein tái tổ hợp bắt đầu đƣợc tổng hợp từ pha log ngay sau khi bổ sung IPTG vào mơi trƣờng. Trong q trình ni cấy, khi tế bào sinh trƣởng tới một mức sinh khối nhất định ở pha cân bằng, là khoảng thời gian mà nguồn dinh dƣỡng bị cạn dần, nên tế bào có khuynh hƣớng tiết nhiều protease để phân hủy tế bào chết và chuyển hóa các sản phẩm phụ thành nguồn dinh dƣỡng để duy trì tế bào. Nếu thu tế bào quá muộn, nhiều tế bào già bị chết nên hàm lƣợng protein tái tổ hợp cũng giảm đi, lƣợng protein tái tổ hợp chỉ đạt tối đa ở một thời điểm nhất định. Do đó, cần phải xác định thời điểm thích hợp để thu nhận hàm lƣợng protein SEC1 tái tổ hợp.
Hình 3.10. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
M: thang protein chuẩn, 1-4: Protein tan tổng số trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS-21a-sec1 được nuôi cấy ở các điều kiện thời gian lần lượt là: 8h; 5h; 2h; 0h
Trong thí nghiệm này, chủng tái tổ hợp mang gen sec1 đƣợc cảm ứng với 0,5mM IPTG và nuôi cấy ở 30oC để sinh tổng hợp protein tái tổ hợp. Tế bào đƣợc thu ở các thời điểm khác nhau: 0, 2, 5, 8 giờ để kiểm tra lƣợng SEC1 pha tan trên gel polyacrylamide nhằm xác định thời gian thích hợp cho việc thu nhận protein tái tổ hợp. Kết quả (Hình 3.10) cho thấy lƣợng protein tái tổ hợp SEC1 đƣợc tổng hợp lớn nhất sau 8 giờ cảm ứng.
Nhƣ vậy, điều kiện thích hợp để cảm ứng biểu hiện protein SEC1 trong chủng biểu hiện E. coli BL21 là ở nhiệt độ 30oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM và thu protein sau 8 giờ cảm ứng.
3.1.6. Tinh sạch protein SEC1 tái tổ hợp
Nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn SEC1 để tinh sạch, các điều kiện nuôi cấy thích