Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED

1.1 .TỤ CẦU KHUẨN

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.3.1. Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED

SEC1, SED và SEE) của tụ cầu

- Thiết kế bộ que thử:

+ Cố định kháng thể vạch thử nghiệm (IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E)) và kháng thể vạch kiểm chứng (IgY kháng BSA) lên màng nitrocellulose lần lƣợt ở vị trí 25mm và 30 mm kể từ đầu que thử (Hình 2.5)

+ Gắn các hợp phần của que thử: màng nitrocellulose, giấy thấm lên tấm lót plastic, màng đƣợc cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm.

Hình 2.5. Sơ đồ que thử phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu

- Nguyên lý của bộ sinh phẩm:

+ Nếu độc tố khơng có trong mẫu phân tích, thì khi kháng nguyên SEC1 – nanocarbon di chuyển lên phía trên que thử, đi về phía vùng kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) sẽ gắn với kháng thể. Sự xuất hiện màu ở vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không chứa độc tố tụ cầu. Ngƣợc lại, độc tố có trong mẫu phân tích, chúng sẽ cạnh tranh vị trí gắn với kháng nguyên cộng hợp để gắn với kháng thể tại vạch thử nghiệm. Do đó, sự khơng xuất hiện màu ở vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu phân tích chứa độc tố ruột tụ cầu.

+ Trong quy trình gắn nanocarbon-SEC1, BSA đƣợc bổ sung vào để phong bế các vị trí có thể liên kết với protein của nanocarbon. Do đó, khi cộng hợp nanocarbon dịch chuyển lên vạch kiểm chứng đƣợc cố định kháng thể IgY kháng BSA thì BSA có

gắn nanocarbon sẽ liên kết với kháng thể kháng BSA nên xuất hiện màu ở vạch kiểm chứng trên que thử.

Kết quả phân tích đƣợc đánh giá dƣ̣a vào viê ̣c xu ất hiện vạch. Kết quả đƣợc coi là dƣơng tính nếu chỉ xuất hiện vạch kiểm chứng . Ngƣơ ̣c la ̣i, kết quả đƣợc coi là âm tính nếu xuất hiện tín hiệu tại cả vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng .

* Gắn cộng hợp nanocarbon cho kháng nguyên SEC1 tái tổ hợp

Kháng nguyên SEC1 tái tổ hợp sau khi tinh sạch đƣợc gắn với hạt nano carbon 100 nm theo khuyến cáo của n hà sản xuất (Maiia Diagnostics). Quy trình chuẩn bi ̣ đƣơ ̣c tóm tắt nhƣ sau: dung dịch huyền phù carbon nồng đô ̣ 10 mg/ml đƣợc pha loãng 10 lần trong dung di ̣ch đê ̣m borat 5 mM, pH 8,5 để thu nhận dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Tiếp đó, dung dịch huyền phù này đƣợc siêu âm trong 2 phút bằng máy siêu âm Sonics VibraCell với 30% biên đơ ̣. Sau đó, 50 µg SEC1 chứa trong thể tích 500 μl dung dịch đệm borat 5 mM; pH 8,5 đƣợc trộn đều với 500 µl dung dịch huyền phù ha ̣t carbon 1mg/ml. Sau khi ủ 1 giờ ở 30oC, hỗn hợp đƣợc bổ sung 1% BSA và tiếp tục trộn trong 30 phút. Hỗn hợp đƣợc rửa bằng cách ly tâm 14.000 g trong 20 phút, loại bỏ dịch nổi, thêm vào 500 μl dung dịch đệm bảo quản (đệm borat 100 mM; pH 8,5, 1% BSA; 0,02% NaN3). Bƣớc rửa đƣợc lặp lại 3 lần. Phức hợp phát hiện kháng nguyên - nano carbon đƣợc chứa trong 500 μl dung dịch đệm bảo quản, để trong bóng tối, ở 4°C.

* Cố định kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) và IgY kháng BSA lên màng nitrocellullose

Màng nitrocelullose AE99 (Whatman) đƣợc cố định lên các lá vinyl Mylar AD back 79373 (Whatman). Kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) và kháng thể IgY kháng BSA đƣợc phun lên trên màng nitrocellulose lần lƣợt ở vạch thử nghiệm và va ̣ch kiểm chƣ́ng b ằng thiết bị Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ). Ở vị trí vạch thử nghiệm trên màng, lƣơ ̣ng kháng thể đƣợc phun lên màng từ 0,2 µg; 0,6 µg đến 2 µg/que thử, ở vạch kiểm chứng , lƣợng kháng thể đƣợc phun là 0,04 µg; 0,12 µg và 0,4µg/que thử. Vị trí cố định c ủa vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng lần lƣợt là 25mm và 30 mm kể từ đầu que thử. Sau đó, màng đƣợc ủ ở 37oC qua

đêm để làm khô. Sau khi gắn thêm giấy thấm, màng đƣợc cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm bằng máy cắt Autokun.

- Lựa chọn lượng kháng thể in lên vạch kiểm chứng

Kháng thể IgY từ lô gà tiêm kháng nguyên BSA sau khi tinh sạch đƣợc cố định lên vạch kiểm chứng của que thử với liều lƣợng khác nhau: 0,4 µg; 0,12 µg và 0,04 µg /que thƣ̉. Tiếp đó, sử dụng các que thử này để phân tích với liều lƣợng kháng thể cộng hợp là 2 µl/100 µl đệm chạy (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20; 0,02% NaN3).

- Lựa chọn lượng kháng thể in lên vạch thử nghiệm

Kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) sau khi tinh sạch đƣợc cố đi ̣nh lên vạch thử nghiệm với liều lƣợng khác nhau : 0,2 µg; 0,6 µg và 2 µg /que thƣ̉. Vạch kiểm chứng đƣợc in kháng thể IgY kháng BSA với hàm lƣợng là nồng độ đƣợc lựa chọn ở kết quả thí nghiệm lựa chọn lƣợng kháng thể in lên vạch kiểm chứng (hàm lƣợng kháng thể thấp nhất mà cho vạch kiểm chứng rõ nét). Tiếp đó, sử dụng các que thử này để phân tích mẫu âm tính với liều lƣợng kháng thể cộng hợp là 2 µl/100 µl đệm chạy.