Ƣu điểm của phƣơng pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh là đơn giản hóa quy trình phát triển que thử do chỉ cần sử dụng một kháng thể. Hiện nay, trên thị trƣờng chƣa có một cặp kháng thể thƣơng mại nào có thể bắt cặp với cả 5 loại độc tố tụ cầu (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) nên nếu sử dụng phƣơng pháp miễn dịch cạnh tranh, chỉ cần sử dụng một kháng thể có khả năng liên kết đặc hiệu với 5 loại độc tố tụ cầu trên thì đã có thể phát triển đƣợc que thử sắc ký miễn dịch phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu phổ biến này. Trong luận án này, chúng tơi đã sử dụng ƣu điểm đó để tạo que thử phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu chỉ dựa trên một kháng thể IgY kháng (SEA, SEB, SEC, SED, SEE). Ngƣợc lại, nhƣợc điểm của sắc ký miễn dịch cạnh tranh là độ nhạy thấp hơn so với sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi do sử dụng chỉ một kháng thể có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên.
1.4.2. Một số nghiên cứu tạo que thử phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm
Năm 2009, trong nghiên cứu của Boyle và các cộng sự đã sử dụng que thử dựa trên nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi để phát hiện độc tố ruột SEB của tụ cầu trong sữa và các sản phẩm của sữa với nồng độ thấp nhất từ 0,25 ng/ml tới nồng độ cao nhất có thể phát hiện là 50 µg/ml, trong 20 phút [20]. Các thực phẩm đƣợc kiểm tra bao gồm sữa có 2% chất béo, sữa có hƣơng liệu và các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa nhƣ sữa chua, sữa cho trẻ sơ sinh và kem. Các tác giả đã nhận thấy việc sử dụng que thử sắc ký miễn dịch để kiểm tra SEB trong các sản phẩm từ sữa đã giảm thiểu thời gian chuẩn bị mẫu. Các mẫu sữa (sữa 2% chất béo, sữa cho trẻ sơ sinh) có thể khơng cần pha lỗng vì có khả năng chảy một cách dễ dàng vào que thử, còn các mẫu sữa và sản phẩm của sữa (sữa socola, kem, sữa chua) cần đƣợc pha loãng để có thể chảy đƣợc trên que thử. Điều thú vị là, mặc dù trong sữa chua có chất phụ gia là hoa quả, màu thực phẩm và có chứa chất béo nhƣng điều đó cũng khơng ảnh hƣởng đến sự phát hiện SEB. Trong các thử nghiệm phát hiện SEB này, màu trên que thử đã không bị nhạt đi khi để ở nhiệt độ phòng sau 30 phút. Báo cáo của Boyle cho thấy việc sử dụng thành công kỹ thuật sắc ký miễn dịch trong việc phát hiện nhanh sự có mặt của SEB trong sữa và sản phẩm của sữa [20].
Năm 2013, Keiko Yamada đã công bố nghiên cứu tạo que thử sắc ký miễn dịch phát hiện SEA trong sữa và sản phẩm của sữa dựa trên nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi [109]. Trong nghiên cứu này, kháng thể gà IgY đa dòng kháng độc tố SEA tái tổ hợp đƣợc in lên vạch thử nghiệm của que thử sắc ký miễn dịch, kháng thể gà IgY đơn dòng kháng SEA tái tổ hợp đƣợc dùng làm kháng thể cộng hợp gắn keo vàng. Để chuẩn bị các mẫu mô phỏng độc tố trong thực phẩm, 102 CFU /ml chủng vi khuẩn S. aureus sinh độc tố SEA đƣợc nuôi cấy trong sữa với những khoảng thời gian khác nhau (0; 5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 hoặc 9h) để sinh các lƣợng độc tố khác nhau tƣơng ứng, trộn dịch sữa chứa độc tố này vào các sản phẩm sữa (kem, sữa chua và cà phê sữa), sau đó thử nghiệm với que thử. Que thử đƣợc áp dụng thành công trong việc phát hiện trực tiếp SEA (0,2 ng/ml-50µg/ml) trong sữa, trong vịng 15 phút.
Gần đây, nhóm nghiên cứu tại Viện Cơng nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp
đôi để tạo que thử phát hiện SEA trong sữa thanh trùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các kháng thể thƣơng mại của hãng Abcam là kháng thể đa dòng thỏ kháng SEA làm kháng thể cộng hợp gắn hạt nano carbon, kháng thể đa dòng cừu kháng SEA để in lên vạch thử nghiệm, kháng thể cừu kháng kháng thể thỏ in lên vạch kiểm chứng , sau đó thử giới hạn phát hiện trong đệm và trong sữa của que thử . Kết quả là que thử có thể phát hiện nồng độ thấp nhất 1 ng/ml đối với SEA trong đệm, còn với sữa thanh trùng nhiễm chủ động SEA , nồng độ thấp nhất que thử xác đi ̣nh đƣợc là khoảng 3 ng/ml.
Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tơi đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để tạo que thử phát hiện nhanh độc tố ruột A của tụ cầu. Trong nghiên cứu này, độc tố ruột SEA tái tổ hợp đƣợc sản xuất và in lên vạch thử nghiệm của que thử, kháng thể đa dòng IgG thỏ kháng SEA đƣợc gắn với hạt nano carbon, sau khi tối ƣu hóa lƣợng SEA cần cố định và lƣợng kháng thể cộng hợp cần sử dụng, ngƣỡng phát hiện của que thử đƣợc xác định là khoảng 80ng/ml.
1.5. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA IgY
1.5.1. Kháng thể lòng đỏ trứng IgY
Năm 1893 Kleperer lần đầu tiên đã mô tả khả năng miễn dịch thụ động thu đƣợc ở gà. Ông đã chứng minh có sự di truyền các yếu tố miễn dịch chống lại độc tố uốn ván từ gà mái sang gà con [41]. Ngay từ năm 1962, Williams đã xác định protein IgY là ɤ - globulin trong phần livetin của lòng đỏ trứng gà. Các loại kháng thể IgY trong lịng đỏ trứng có thể kháng khoảng 200 loại kháng nguyên khác nhau [71]. Nồng độ của các loại kháng thể này trong máu gà là 5-6 mg/ml, trong khi đó ở lịng đỏ trứng là 10-25 mg/ml. Nồng độ IgY trong cả máu và lòng đỏ trứng là thấp hơn so với IgG trong máu của động vật có vú, ví dụ: nồng độ IgG trong máu thỏ là 35 mg/ml [83]. Tuy nhiên gà đẻ trứng mỗi ngày nên từ lƣợng lớn trứng thu đƣợc có thể tách chiết đƣợc đủ lƣợng kháng thể để dùng. Khi thỏ và gà đƣợc so sánh về sản xuất kháng thể (Bảng 1.5), ngƣời ta có thể rút ra kết luận đáng ngạc nhiên: một con gà sản xuất trong một năm đƣợc lƣợng kháng thể nhiều bằng lƣợng kháng thể thu thập đƣợc từ máu của 40 con thỏ [52]. Lịng đỏ trứng chứa khoảng 100 ÷ 150 mg IgY. Gà mái đẻ khoảng
280 trứng trong một năm. Nếu gà mái đƣợc tiêm chủng sẽ tạo ra 40g IgY một năm từ trứng, tƣơng đƣơng với lƣợng kháng thể thu đƣợc từ máu của 40 con thỏ.
Bảng 1.5. So sánh kháng thể IgG ở thỏ và IgY ở gà [52]
Động vật Thỏ (IgG) Gà (IgY)
Nguồn kháng thể Huyết thanh Lòng đỏ trứng
Loại kháng thể Đa dòng Đa dòng
Cách thu kháng thể Lấy máu Lấy trứng
Lƣợng kháng thể 200mg/1 lần lấy máu (400ml)
100-150mg/trứng
Tổng lƣợng kháng thể/năm 1400mg 40.000mg
Lƣợng kháng thể đặc hiệu Khoảng 5% Khoảng 2-10%
Liên kết với protein A/G Có Khơng
Tƣơng tác với IgG Có Khơng
Tƣơng tác với khớp dạng thấp Có Khơng
Kích hoạt bổ thể Có Khơng
Kháng thể IgY có chức năng tƣơng tự IgG ở động vật có vú, đƣợc vận chuyển vào lòng đỏ trứng gà để bảo vệ thụ động gà con. Ở gà có ba lớp kháng thể: IgY, IgA và IgM. Trong suốt quá trình hình thành trứng, IgY trong huyết thanh đƣợc vận chuyển chọn lọc vào lịng đỏ trứng gà thơng qua một thụ thể đặc hiệu trên bề mặt của màng lòng đỏ, trong khi IgA và IgM ở lịng trắng trứng (Hình 1.10) [52] . Việc vận chuyển kháng thể vào lòng đỏ trứng đƣợc khai thác để sản xuất kháng thể đặc hiệu với các kháng nguyên trong nhiều ứng dụng về y tế và các lĩnh vực nghiên cứu, bao gồm các lĩnh vực nhƣ chẩn đoán và proteomic [83, 101]. IgY có thể đƣợc sử dụng trong hóa miễn dịch với chức năng tƣơng tự IgG của động vật có vú. Kháng thể IgY là một thay thế hấp dẫn cho kháng thể động vật có vú vì các lý do kinh tế, lý do đạo đức sinh học và vì sự an tồn của động vật.
Buồng trứng
Ống dẫn trứng
Trứng