Nhóm Các độc tố ruột của tụ cầu
Nhóm 1 SEA, SED, SEE SElJ, SElN, SElO, SElP, SES Nhóm 2 SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SEG, SER , SElU, SElU2 Nhóm 3 SEI, SElK, SElL, SElM, SElQ, SElV
Nhóm 4 SET
Nhóm 5 SEH
1.2.3. Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu
Các SE thuộc họ độc tố gây sốt có nguồn gốc từ các loài tụ cầu và liên cầu. Các độc tố gây sốt này bao gồm các SE và độc tố gây sốt liên cầu A và B [63]. Mặc dù các độc tố này liên quan tới các tác nhân gây bệnh khác nhau nhƣng chúng có chung hoạt tính sinh học: gây sốt, kích hoạt hệ miễn dịch và tăng nhanh số lƣợng tế bào T khơng chun biệt. Những hoạt tính này đƣợc gọi là hoạt tính siêu kháng nguyên (superantigen). Bên cạnh những đặc điểm chung này, chỉ riêng các SE có hoạt tính gây
nơn [107]. Hoạt tính siêu kháng ngun và hoạt tính gây nơn đƣơ ̣c qút đi ̣nh bởi 2 vùng protein ri êng biệt nhƣng sự liên hệ giữa hai hoạt tính này vẫn chƣa đƣợc làm rõ [43]. Tuy nhiên, trong hầu hết trƣờng hợp, hai hoạt tính này tồn tại song song nhau, những đột biến làm mất hoạt tính siêu kháng nguyên cũng làm mất hoạt tính gây nơn [53].
1.2.3.1. Hoạt tính siêu kháng nguyên
Năm 1960, Bergdoll và cộng sự là những ngƣời đầu tiên đã phát hiện đƣợc hoạt tính siêu kháng nguyên ở vi khuẩn [Trích theo35]. Dựa vào các đặc tính của độc tố ruột gồm hoạt tính siêu kháng ngun và hoạt tính gây nơn, họ đã phân lập đƣợc một độc tố tiết ra bởi S. aureus và gọi là độc tố ruột tụ cầu A (SEA) [35]. Tuy nhiên, thuật ngữ siêu kháng nguyên chỉ đƣợc sử dụng từ năm 1989, khi Marrack và cộng sự quan sát, các tế bào T phát triển tràn lan khi các độc tố này đƣợc nhận diện bởi các chuỗi Vß chuyên biệt của thụ thể thuộc tế bào T [63]. Các siêu kháng nguyên là những chất gây phân bào, nhất là đối với tế bào T [86]. Với các kháng nguyên thông thƣờng, sự xuất hiện phức hợp MHC II (major histocompatibility complex- II) trên các tế bào trình diện kháng nguyên (antigen presenting cell - APC) cần đƣợc tạo ra bởi 5 yếu tố khác nhau của thụ thể tế bào T (T- cell receptor- TCR) là Vβ, Dβ, Jβ, Vα và Jα [10, 104]. Ngƣợc lại, các siêu kháng nguyên đƣợc nhận ra chủ yếu bởi phần Vβ của TCR. Các SE liên kết trực tiếp với các phân tử MHC II ở các rãnh liên kết kháng nguyên peptit bên ngoài các APC (Hình 1.5). Các SE liên kết với các MHC II, sau đó chúng có thể liên kết với các tế bào T thông qua TCR một cách "không đặc hiệu", chỉ qua vùng biến đổi Vβ trên TCR, chúng tạo một liên kết chéo giữa vùng biến đổi Vβ và protein MHC- II. Phức hợp này không phụ thuộc vào liên kết peptit với thụ thể tế bào T. Sự tƣơng tác giữa ba phân tử: MHCII - SE - TCR dẫn đến một sự giải phóng khơng kiểm soát các chất cytokine nhƣ: IFN- γ, TNF-α, IL-1ß, IL-6 và IL-8, là nguyên nhân chính gây viêm cấp tính và sốc [19, 104]. Thông thƣờng, các tế bào T chỉ đƣợc hoạt hóa một cách đặc hiệu với kháng nguyên nhƣng khi các tế bào này tƣơng tác với các SE thì đã xảy ra sự phát triển quá độ, chủ yếu là Th1 và Th17 [21, 102], cả hai đều có liên quan đến phản ứng viêm cấp tính. Thêm vào đó là sự chết tế bào và thiếu hụt các đáp ứng từ
tế bào T [43], hệ quả là có một phản ứng miễn dịch yếu đối với độc tố. Sự ức chế miễn dịch của tế bào T và tế bào B dẫn tới sự suy giảm đáp ứng miễn dịch với các tác nhân xâm nhập khác [18, 104]. Do đó, cơ thể có thể sẽ khơng phản ứng với một chất hoặc yếu tố gây bệnh mà cơ thể đã có đáp ứng miễn dịch trƣớc đó. Các siêu kháng ngun có thể kích thích khoảng 20% tổng số các tế bào lympho T, trong khi kháng nguyên thơng thƣờng chỉ hoạt hóa 0,1% các tế bào này [13]. Mặt khác, sự tổng hợp và giải phóng quá mức cytokin là phản ứng gây ra các hậu quả nghiêm trọng nhất của các siêu kháng nguyên, dẫn đến sốc, hạ huyết áp, ngừng hoạt động của các cơ quan khác nhau và có thể dẫn đến tử vong [66, 67]. Tử vong ở ngƣời lớn khỏe mạnh là hiếm (0,03%) nhƣng tỷ lệ tử vong là cao hơn ở trẻ em, ngƣời già và ngƣời lớn suy giảm miễn dịch và cũng có thể phụ thuộc vào nồng độ của các độc tố tiêu hóa [36].
Hình 1.5. Mơ hình tương tác của SE với thụ thể tế bào T và với phân tử MHC II Ghi chú: SE một mặt gắn với Vβ của TCR, một mặt gắn với MHC-II nên có thể
kích hoạt cả tế bào APC và tế bào T, dẫn tới việc sản xuất các cytokine của cả hai loại tế bào [104].
1.2.3.2. Hoạt tính gây nơn
Hoạt tính gây nơn không đƣợc mô tả rõ nhƣ hoạt tính siêu kháng nguyên do thiếu mô hình động vật phù hợp. Linh trƣởng là động vật lý tƣởng để nghiên cứu hiệu ứng nôn của các SE, nhƣng do chi phí nghiên cứu là khá cao và tồn tại một số vấn đề
SE gây viêm ruột ở khỉ Macaca mulatta, ngƣời ta nhận thấy 0,9 μg độc tố/kg cơ thể đã đạt đƣợc 50% liều gây độc dẫn tới nơn ở lồi khỉ này [100]. Bên cạnh đó, khi lợn sữa sử dụng ống thơng cho độc tố SEA vào ruột thì sau 90 đến 180 phút, lợn này xảy ra các triệu chứng nhƣ buồn ngủ, bồn chồn, mất tạm thời của các phản xạ thăng bằng, bỏ ăn và nôn. Liều gây nôn 50% là 40-50 μg cho lợn sữa 4,1 đến 9,1 kg và 20 μg cho lợn sữa từ 0,9 đến 2,3 kg [98]. Ngoài ra, một loài động vật khác đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu là chuột chù xạ hƣơng (chuột chù nhà). Sau hai giờ cho chuột uống hoặc tiêm các độc tố ruột vào màng bụng thì chuột có phản ứng nơn [48]. Các nghiên cứu của Hu và các cộng sự cho thấy: ruột non là vị trí kích thích nơn khi thí nghiệm với độc tố SEA và dƣờng nhƣ liên quan đến hội chứng serotonin (hydroxytryptamine – 5, 5-HT) [49]. Serotonin là một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng, đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa và có thể kích hoạt tế bào thần kinh ruột, tăng nhu động ruột và tăng sự bài tiết. Một nghiên cứu gần đây cho thấy amino acid ở vị trí 227 (Aspartic) của SEA đóng vai trị quan trọng trong hoạt tính gây nôn. Khi thay thế Aspartic bởi Alanine ở vị trí này thì SEA bị mất hoạt tính gây nơn [50].
1.2.3.3. Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu
Lớp tế bào biểu mô đƣờng ruột tạo thành hàng rào bảo vệ cơ thể khỏi sự tác động của một lƣợng lớn các kháng nguyên từ thức ăn, vi khuẩn và virus. Các phản ứng miễn dịch với các SE gây ra viêm dạ dày ruột. Điều này dẫn đến sự tăng tính thấm của biểu mơ đƣờng ruột và giảm sự biểu hiện của các protein khác. Các SE có thể vƣợt qua hàng rào biểu mơ nguyên vẹn, tăng tiếp xúc với các tế bào T. Đại thực bào (tế bào trình diện kháng nguyên chuyên biệt) cũng đƣợc kích hoạt bởi các SE để giải phóng các yếu tố hoạt hóa bạch cầu trung tính và các cytokine [32, 33].
Đối với các tế bào mô xơ hóa (tế bào trình diện kháng nguyên không chuyên biệt) trên biểu mơ ruột, khi chúng đƣợc kích hoạt bởi các SE gắn trên MHC – II cũng sản xuất các cytokine tiền viêm nhƣ IL-6, IL-8 và TNF-α [85]. Nghiên cứu của Victor E.Reyes năm 2010 đã cho rằng SEA có thể vƣợt qua một lớp đơn của các tế bào biểu mô đƣờng ruột và liên kết với MHC-II ở trên các mơ xơ hóa của biểu mơ ruột, sản xuất MCP-1 cùng với các cytokine tiền viêm đề cập ở trên [104]. Các kết quả từ nghiên cứu
này cũng cho thấy rằng MCP-1 có thể đƣợc tham gia vào hóa hƣớng của tế bào lympho nhƣ minh họa trên Hình 1.6.
Hình 1.6 . Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu [104]
Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu thực hiện thông qua các hiệu ứng siêu kháng nguyên của SE khi chúng gắn trên MHC lớp II đƣợc trình diện bởi các tế bào trình diện kháng nguyên, nhƣ các đại thực bào, các tế bào tua (các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên biệt), các tế bào mơ xơ hóa (tế bào trình diện kháng ngun khơng chun biệt - myofibroblast) và TCR biểu hiện bởi các tế bào T CD4+ [104]. Các SE có thể vƣợt qua hàng rào biểu mô đƣờng ruột ở dạng nguyên vẹn và liên kết với các phân tử MHC lớp II ở trên myofibroblast. Các quá trình này sẽ dẫn đến sự sản xuất mạnh mẽ của các cytokine tiền viêm và chemokine, bao gồm IL - 6, IL - 8 và MCP - 1, làm tăng tính hƣớng hóa của các tế bào miễn dịch chuyên biệt (CD4 +, tế bào T, đại thực bào) từ mô bạch huyết ruột – GALT (gut asociated lymphoid tisue) tới các vị trí viêm dạ dày - ruột (GI) do độc tố tụ cầu. Sự tƣơng tác với MHC lớp II của các SE - TCR có thể gây kích hoạt mạnh đối với các APC và các tế bào T, dẫn đến sự gia
tăng quá mức của các tế bào T và sự giải phóng khơng kiểm sốt các cytokine tiền viêm và các chemokine khác, gây ra viêm và sốc cấp tính [104, 18].
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU
Để phát hiện SE trong thực phẩm, có thể sử dụng phép thử sinh học, phƣơng pháp sinh học phân tử hoặc các phƣơng pháp miễn dịch.
1.3.1. Phép thử sinh học
Nguyên tắc của các phép thử sinh học dựa trên việc phân tích khả năng gây các triệu chứng điển hình nhƣ nơn , tiêu chảy trên các động vật thí nghiệm hoặc hoạt động siêu kháng ngun trong ni cấy tế bào . Thông thƣờng, các SE sẽ đƣợc tách chiết từ thƣ̣c phẩm bằng các dung dịch đệm thích hợp , trải qua bƣớc tinh chế bằng phƣơng pháp sắc ký, sau đó cho dịch chiết độc tố này vào dạ dày động vật hoặc tiêm vào màng bụng: cho vào dạ dày khỉ bằng đƣờng ống thông , cho chuột chù nhà và mèo uống hoặc tiêm vào màng bụng chúng [48, 100]. Tiếp theo, tiến hành theo dõi các triê ̣u chƣ́ng lâm sàng của động vật thí nghiệm. Nếu thấy xuất hiện các biểu hiện điển hình nhƣ tiêu chảy, nôn thì có thể kết luâ ̣n là thƣ̣c phẩm bi ̣ nhiễm các SE . Tuy nhiên, liều lƣợng SE tối thiểu cần sử dụng trong các phép thử sinh học là khoảng 200 ng [104], cao hơn nhiều so với liều gây ngộ độc thực phẩm ở ngƣời (20 – 100ng) [51]. Vì vậy, phƣơng pháp phát hiện độc tố tụ cầu bằng phép thử sinh học không đủ nhạy để kiểm nghiệm thực phẩm đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng. Ngồi ra, vì lý do đạo đức sinh họ c, hiện nay việc sử dụng các động vật để thí nghiệm đang bị hạn chế.
1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
Các phƣơng pháp sinh học phân tử thƣờng sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện các gen mã hóa các độc tố SE trong thực phẩm dựa trên các trình tự mồi chuyên biệt cho các gen mã hóa độc tố SE. Các phản ứng PCR thƣờng dùng là uniplex và multiplex PCR và gần đây là real-time PCR [25, 12, 110]. Các phƣơng pháp này có ƣu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, cho phép phát hiện nhanh Staphylococcus tạo độc tố với một lƣợng mẫu nhỏ. Hơn nữa, có thể phát hiện đƣợc cả những tế bào sinh độc tố đã chết, điều này rất quan trọng trong việc phân tích các mẫu thực phẩm đã xử lí nhiệt liên quan đến những vụ ngộ độc thực phẩm. Tuy nhiên, hạn chế cơ bản của loại phƣơng pháp này là nó chỉ cho biết sự có mặt hay khơng của các gen mã hóa SE
trong thực phẩm mà không cho biết sự biểu hiện của các gen này.
1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch
Hiện nay, phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất để phát hiện SE trong thực phẩm là các phƣơng pháp miễn dịch , nhờ tƣơng tác đă ̣c hiê ̣u giƣ̃a kháng nguyên và kháng thể.
1.3.3.1. Phương pháp khuếch tán trên gel (Microslide Double Diffusion )
Phƣơng pháp khuếch tán trên gel dựa vào các tƣơng tác đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể là phƣơng pháp đầu tiên trong phịng thí nghiệm có thể xác định các SE. Từ những năm 1950, các phƣơng pháp khuếch tán trên gel đƣợc phát triển nhƣ phƣơng pháp khuếch tán trên gel đơn [80], phƣơng pháp ống khuếch tán gel khép [75], phƣơng pháp đĩa [79] và phƣơng pháp khuếch tán trên gel microslide [29]. Phƣơng pháp microslide là phƣơng pháp nhạy nhất trong các phƣơng pháp khuếch tán trên gel. Áp dụng kỹ thuật khuếch tán trên gel microslide để phát hiện các SE cần nồng độ độc tố tối thiểu là 30-60 ng SE trong mỗi gam thực phẩm [90]. Do đó, tinh sạch bằng sắc ký và cơ đặc mẫu phân tích đƣợc áp dụng để đạt đƣợc nồng độ SE có thể phát hiện đƣợc bởi kỹ thuật này. Phƣơng pháp khuếch tán trên gel đƣợc Hiệp hội các nhà phân tích (Asssociation of Analytical Communities - AOAC) coi là tiêu chuẩn cho việc đánh giá các phƣơng pháp mới [90]. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là ít nhạy khi lƣợng độc tố cần phát hiện ở mức tối thiểu và địi hỏi ngƣời đọc kết quả phải có kinh nghiệm.
1.3.3.2. Phương pháp miễn dịch phóng xạ - RIA (Radio Immunoassay)
Kĩ thuật miễn dịch phát phóng xạ (RIA) là phƣơng pháp đầu tiên có độ nhạy cao (0,6 – 6 ng kháng thể/ml) đƣợc sử dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm. Trong phƣơng pháp này, độc tố đƣợc đánh dấu bằng 125I [91]. Dịch chiết thực phẩm đƣợc cho vào cùng với kháng thể chuyên biệt trong một ống nhựa nhỏ trƣớc khi thêm độc tố đƣợc đánh dấu. Sau đó, xác định lƣợng độc tố trong dịch chiết thực phẩm bằng cách đo tính phóng xạ của chất kết tủa [103, 91]. Hiện nay, phƣơng pháp này khơng cịn đƣợc sử dụng nữa vì đã có những phƣơng pháp mới hơn khơng cần dùng những vật liệu có tính phóng xạ.
1.3.3.3. Ngưng kết hạt latex (Reversed Passive Latex Aggulutination - RPLA)
Kỹ thuật ngƣng kết hạt latex (RPLA) đƣợc ứng dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm cũng nhƣ phát hiện độc tố trong những dòng tụ cầu. Trong kỹ thuật này, hạt nhựa đƣợc phủ kháng thể của độc tố trƣớc khi cho vào giếng [87]. Dịch chiết mẫ u thực phẩm đƣợc cho vào giếng để tạo phản ứng. Nếu có độc tố trong mẫu thì phản ứng giữa độc tố và kháng thể sẽ tạo ra sự ngƣng kết, màng đƣợc tạo thành dƣới đáy giếng, cịn nếu khơng có độc tố thì khơng xảy ra ngƣng kết, do đó phản ứng tạo thành giọt ở đáy giếng. Lƣợng độc tố đƣợc xác định nhờ xác định hiệu giá kháng thể cao nhất mà ở đó cịn xảy ra phản ứng ngƣng kết. Kỹ thuật này đủ nhạy để phát hiện độc tố trong hầu hết thực phẩm của các vụ ngộ độc, cũng nhƣ trong việc phát hiện những dòng tụ cầu tạo ra lƣợng độc tố thấp (10-20 ng/ml) mà phƣơng pháp khuếch tán trên gel không phát hiện đƣợc. Bộ kit thƣơng mại SET-RPLA của công ty Denka Seiken, Tokyo, Nhật Bản đang đƣợc bán tại Mỹ phát hiện đƣợc các SE SEA, SEB, SEC và SED [44].
1.3.3.4. Các phương pháp dựa trên kỹ thuật ELISA
Nguyên lý của phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ gắn enzym (ELISA) là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể vốn đƣợc cố định trên một phiến nhựa (giá đỡ pha rắn) và việc sử dụng phản ứng enzym - cơ chất sẽ gây chuyển màu, qua đó để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể cần phát hiện.
Trên thị trƣờng thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện các SE trong thực phẩm (RIDASCREEN, TECRA, TRANSIA và VIDAS). Nguyên tắc hoạt động của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA kẹp đôi. Đầu tiên, mô ̣t kháng thể đă ̣c hiê ̣ u nhâ ̣n biết SE sẽ đƣợc cố đi ̣nh lên bề mă ̣t của mô ̣t giếng nhƣ̣a. Sau quá trình rƣ̉a để loa ̣i bỏ các kháng thể không đƣợc cố đi ̣nh , mẫu phân tích sẽ đƣợc đƣa vào giếng. Nếu nhƣ trong mẫu phân tích có SE , khi đó sẽ xảy ra phản