Phƣơng pháp
Nồng độ độc tố SEE (ng/ml)
Que thử + + + + + + - - -
{ TC "III.6.2.1. Xác định độ nhạy phát hiện SEA trong sữa" \f C \l "4" } { TC
"III.6.2.1. Xác định độ nhạy phát hiện SEA trong sữa" \f C \l "4" }
Hình 3.34. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên thịt
1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính thịt khơng chứa SEE và 9: mẫu âm tính đệm khơng chứa SEE
Kết quả thể hiện trên Bảng 3.16 và Hình 3.34 cũng cho thấy trên mẫu thịt gây nhiễm độc tố SEE thực nghiệm, que thử có thể phát hiện đƣợc độc tố SEE ở nồng độ pha lỗng 9 ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện của que thử cũng là 9 ng/ml (que thử số 6).
Nhƣ vậy, giới hạn phát hiện của que thử với cả 5 độc tố ruột SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trên thịt là 9 ng/ml ở điều kiện phịng thí nghiệm.
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã sản xuất và tinh sạch đƣợc độc tố ruột tụ cầu tái tổ hợp SEC1 ở dạng dung hợp với đi His - GST có kích thƣớc 57 kDa, có độ tinh sạch cao.
2. Đã sản xuất và tinh sạch kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE), thu đƣợc hàm lƣợng khoảng 5, 9 mg/ml dịch lòng đỏ, với độ tinh sạch cao.
3. Xây dựng đƣợc quy trình chế tạo que thử phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) trên thực phẩm.
4. Đã chế tạo thành công que thử phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trên một số nhóm thực phẩm (sữa và thịt) ở mức độ thử nghiệm trong phịng thí nghiệm. Kháng thể IgY kháng SE(A- E) và kháng thể IgY kháng BSA đƣợc cố định lần lƣợt lên vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng trên màng nitrocellulose, gắn độc tố ruột SEC1 tái tổ hợp với hạt nanocarbon tạo kháng nguyên cộng hợp với các hàm lƣợng tƣơng ứng là 0,6 µg/ que thử; 0,12 µg/ que thử và 0,2 µg/que thử.
5. Sử dụng que thử đã phát hiện đƣợc 5 loại độc tố ruột tụ cầu SE (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) trên một số nhóm mẫu thực phẩm (sữa, thịt) gây nhiễm thực nghiệm với giới hạn phát hiện nhƣ sau: Với SEA, SEB và SED: giới hạn phát hiện của que thử trong đệm chạy là 30 ng/ml, trong sữa là 30 ng/ml và trong thịt là 9ng/ml ở điều kiện phịng thí nghiệm; Với SEC1 và SEE giới hạn phát hiện của que thử trong dung dịch đệm chạy là 10 ng/ml, trong sữa và trong thịt thì giới hạn phát hiện là 9 ng/ml ở điều kiện phịng thí nghiệm.
KHUYẾN NGHỊ
Để triển khai sản xuất, thƣơng mại hóa sản phẩm que thử cần hồn thiện quy trình sản xuất que thử, cụ thể là:
1. Xác định độ đặc hiệu của que thử
2. Tiếp tục nghiên cứu nhằm tối ƣu hóa que thử để tăng độ nhạy phát hiện với 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) trên thực phẩm.
3. Tiếp tục khảo sát độ ổn định của que thử trong thời gian dài hơn với các điều kiện bảo quản khác nhau nhằm đánh giá thời gian sử dụng của que thử trong các điều kiện thực tế khác nhau.
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Thị
Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2012), “Ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để tạo que thử phát hiện nhanh độc tố ruột A của tụ cầu”, Tạp chí Y học
2. Lê Quang Hòa, Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Tô Kim Anh
(2014), “Development of a Lateral Flow Immunoassay for the Rapid Detection of Staphylococcal Enterroxin A in Milk”, VNU Journal of Science; Natural Sciences and Technology, Vol. 30 (3S), pp. 153-157.
3. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2015), “Nghiên
cứu phát triển hệ thống sắc kí miễn dịch cạnh tranh phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu trong sữa”, VNU Journal of Science; Natural Sciences and Technology, Vol. 31, No. 1, pp. 23-31.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Dịp (1993), Ứng dụng những nguyên lý về vi sinh vật học và di truyền học để xác định tính chất dich tễ của Staphylococcus aureus, Luận án Tiến sĩ y học, Đại học Y khoa Hà Nội, Hà Nội.
3. Lê Quang Hòa, Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Hồng Nhung, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Tô Kim Anh (2012), “Sản xuất và thử nghiệm bộ sinh phẩm ELISA phát hiện nhanh độc tố ruột dạng A của tụ cầu”, Tạp chí Y học thực hành (842), tr.217- 220.
4. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Hồng Nhung, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2012), “Ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để tạo que thử phát hiện nhanh độc tố ruột A của tụ cầu”, Tạp chí Y học
thực hành (842), tr.213-217.
5. Nguyễn Hoàng Minh, Lê Quang Hòa, Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Trần Hoa Cƣơng, Tô Kim Anh (2009), “Xây dựng quy trình phân tích phát hiện nhanh độc tố tụ cầu vàng dạng A (SEA) trong sản phẩm thịt sử dụng bộ Kit BK-SETA”, Kỷ yếu hội nghị khoa học An toàn vệ sinh thực phẩm lần thứ 5-2009, tr. 469 – 474.
6. Nghiêm Ngọc Minh (2011), “Biểu hiện và tinh sạch protein nội độc tố Staphylococcal enterotoxin (SEB) trong các chủng Staphylococcus aureus phân
lập từ các vụ ngộ độc thực phẩm”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 86 (10), pp 179-183.
7. Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam.
8. Nguyễn Đỗ Phúc, Trần Linh Thƣớc (2008), “Tạo kháng thể đa dòng và xây dựng quy trình ELISA phát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus”, Tạp
chí Y học TP. Hồ Chí Minh (12), tr. 272-277.
9. Tim Sunnary (2013), Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng
10. Đặng Đức Trạch (1984), Miễn dịch học, University of Amsterdam.
TIẾNG ANH
11. Agro-Bio (2011), Protocol for the production of chicken polyclonal antibodies specific IgY, Version 2011/01.
12. Antonina A Votintseva, Rowena Fung, Ruth R Miller, Kyle Knox, Heather Godwin, David H Wyllie, Rory Bowden, Derrick W Crook, A Sarah Walker (2014), Prevalence of Staphylococcus aureus protein A (spa) mutants in the community and hospitals in Oxfordshire, BioMed Central, United Kingdom.
13. Antonsson, P., Wingren, A.G., Hansson, J., Kalland, T., Varga, M., Dohlsten, M. (1997), “Functional Characterization of the Interaction Between the Superantigen Staphylococcal Enterotoxin A and the TCR”. Journal of Immunology. 158, pp 4245–4251.
14. Asao, T., Kumeda, Y., Kawai, T., Shibata, T., Oda, H., Haruki, K., Nakazawa, H., Kozaki, S (2003), “An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: Estimation of enterotoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk’’, Journal of Epidemiology Infectionous. 130, 33– 40.
15. Asenjo, J.A. and B.A. Andrews (2009), “Protein purification using chromatology: selection of type, modelling and optimization of operating condition”, Journal of Molecular Recognit 22(2), pp 65-76.
16. Atanmassova. V, Meindl. A và Ring. C (2001), “Prevalence of Staphylococcus aureus and staphylococci enterotoxin in raw pork and uncooked smoked ham – a
comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR”, International Journal of Food Microbiology 68: 105-113.
17. Audrey W. Jarvis, R. C. Lawrence, and G. G. Pritchard (1973), “Production of Staphylococcal enterotoxins A, B and C under conditions of controlled pH and aeration”, Journal of Infection and Immunity 7(6), pp 847-854.
18. Balaban N, Rasooly A (2000), “Staphylococcal enterotoxins”, Internatinal Journal of Food Microbiology 61(1): 1-10.rnatio
19. Bergdoll, M.S., Crass, B.A., Reiser, R.F., Robbins, R.N., Davis, J.P. (1981), “A New Staphylococcal Enterotoxin, Enterotoxin F, Associated with Toxic-Shock- Syndrome Staphylococcus aureus Isolates”, Lancet 1, pp 1017–1021.
20. Boyle T., Njoroge JM., Jones RL. Jr., Principato M. (2010), “Detection of staphylococcal enterotoxin B in milk and milk products using immunodiagnostic lateral flow devices”, Journal of AOAC International 93, pp 569-575.
21. Cameron, S.B., Nawijn, M.C., Kum, W.W., Savelkoul, H.F., Chow, A.W. (2001), “Regulation of Helper T Cell Responses to Staphylococcal Superantigens”, European Cytokine Netw (12), pp 210-222.
22. Casman E.P., (1965), “Staphylococcal enterotoxin”, Annals of the New York Academy of Sciences 128, pp 124–131.
23. Cha J.O., Lee J.K., JungY.H., Yoo J.I., Park Y.K., Kim B.S., Lee Y.S.(2006), “Molecular analysis of Staphylococcus aureus isolates associated with
staphylococcal food poisoning in South Korea”, Journal of Applied Microbiology 101, pp 864–871.
24. Chang HC, Bergdoll MS (1979), “Purification and some physicochemical properties of staphylococcal enterotoxin D”, Journal of Biochemistry 18 (10), pp 1937–1942.
25. Chen T.R., Chiou, C.S., Tsen H.Y. (2004), “Use of Novel PCR Primers Specific to the Genes of Staphylococcal Enterotoxin G, H, I for the Survey of
Staphylococcus aureus Strains Isolated From Food-Poisoning Cases and Food
Samples in Taiwan”, International Journal of Food Microbiology 92, pp 189–
197.
26. Christopher Marcq, André Théwis, Daniel Portetelle, Yves Beckers (2013), “Refinement of the production of antigen-specific hen egg yolk antibodies (IgY) intended for passive dietary immunization in animals. A review”, Biotechnology
27. Concordia R. Borja , Merlin S. Bergdoll (1967), “Purification and Partial Characterization of Enterotoxin C Produced by Staphylococcus aureus Strain
137”, Journal of Biochemistry 6 (5), pp 1467–1473.
28. Cook M.E. and Trott D.L (2010), “IgY–immune component of eggs as a source of passive immunity for animals and humans”, world's poultry science journal
66, pp 215-225
29. Crowle A.J (1961), Immunodiffusion, New York: Academic Press.
30. David F. Capenter and Gerald J. Silverman (1974), “Staphylococcal enterotoxin B and nuclease production under controlled dissolved oxygen conditions”,
Journal of Applied Microbiology 28 (4), pp 628-637.
31. De Buyser M.L., Dufour B., Maire M., Lafarge V. (2001), “Implication of milk and milk products in food-borne diseases in France and in different industrialised countries”, International Journal of Food Microbiology 67, pp 1–17.
32. Desouza I.A., Hyslop S., Franco-Penteado, C.F., Ribeiro-DaSilva, G. (2001), “Mouse Macrophages Release a Neutrophil Chemotactic Mediator Following Stimulation by Staphylococcal Enterotoxin Type A”, Journal of Inflammation Research 50, pp 206– 212.
33. Desouza I.A., Hyslop S., Franco-Penteado C.F., Ribeiro-DaSilva, G. (2002), “Evidence for the Involvement of a Macrophage-Derived Chemotactic Mediator in the Neutrophil Recruitment Induced by Staphylococcal Enterotoxin B in Mice”, Toxicon 40, pp 1709-1717.
34. Diana Pauly, Pablo A. Chacana, Esteban G. Calzado, Bjorn Brembs, Rudiger Schade (2011), “IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) precipitation”, Journal of Visualized Experiments (51), pp 1-5.
35. Dinges M.M., Orwin P.M., Schlievert P.M. (2000), “Exotoxins of Staphylococcus
aureus”, Clinical Microbiology Reviews 13, pp 16–34.
36. Do Carmo, L. S., Cummings, C., Linardi, V. R., Dias, R. S., De Souza, J. M., Sena, M. J., Dos Santos, D. A., Shupp, J. U., Poreira, R. K., Jett, M. (2004), A
case study of a massive staphylococcal food poisoning incident. Foodborne
Pathogens and Disease. 1, pp 241-246.
37. Edward J. Schantz , William G. Roessler , Jack Wagman , Leonard Spero , David A. Dunnery , Merlin S. Bergdoll (1965), “Purification of Staphylococcal Enterotoxin B*” , Journal of Biochemistry 4 (6), pp 1011–1016.
38. Evenson M.L., Hinds M.W., Bernstein R.S., Bergdoll M.S (1998), “Estimation of Human Dose of Staphylococcal Enterotoxin A From a Large Outbreak of Staphylococcal Food Poisoning Involving Chocolate Milk”, International Journal of Food Microbiology 7, pp 311–316.
39. Evin K., Brunner. G., My A. and Wong. C (1992), “Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in mushrooms”, Journal of Food Science
57(3), pp 700–703.
40. Goshorn SC, Schlievert PM (1988), “Nucleotide sequence of streptococcal pyrogenic exotoxin type C”, Journal of Microbiology Immunology and Infection 56, pp 2518-2520.
41. Hamal KR., Burgess SC., Pevzner IY., Erf GF. (2006), “Maternal
antibody transfer from dams to their egg yolks, egg whites, and chicks in meat lines of chickens”, Journal of Poultry Science 85(8), pp 1364- 1372.
42. Haeghebaert S., Le Querrec F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V. (2002), “Les toxi-infections alimentaires collectives en France en 1999 et 2000”,
Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire 23, pp 105-109.
43. Harris TO, Grossman D, Kapp.ler JW, Marrack P, Rich RR, Betley MJ (1993), “Lack of complete correlation between emetic and T-cellstimulatory activities of staphylococcal enterotoxins”, Journal of Microbiology Immunology and Infection 61, pp 3175-3183.
44. Hennekine Jacques-Antonie, Annick Ostyn, Florence Guillier, Sabine Herbin, Anne- Laure Prufer and Sylviane Dragacc (2010), “How should Staphylococcal food poisoning outbreaks be characterized?”, Toxins (Basel) (2), pp 2106 – 2116.
45. Hennekinne de Buyser and S. Dragacci (2012), “Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation”, FEMS
Microbiology Reviews 36, pp 815–836.
46. Le Quang Hoa, Tran Thi Sao Mai, Nguyen Thi Khanh Tram, To Kim Anh (2014), “Development of a Lateral Flow Immunoassay for the Rapid Detection of Staphylococcal Enterotoxin A in Milk”, VNU Journal of Science 30, pp 153-157.
47. Hovde CJ, Marr JC, Hoffmann ML, Hackett SP, Chi YI, Crum KK, Stevens DL, Stauffacher CV, Bohach GA (1994), “Investigation of the role of the disulphide bond in the activity and structure of staphylococcal enterotoxin C1”, Journal of Molecular Microbiology 13, pp 897-909.
48. Hu D.L., Omoe K., Shimoda Y., Nakane A., Shinagawa K. (2003), “Induction of Emetic Response to Staphylococcal Enterotoxins in the House Musk Shrew (Suncus Murinus)”, Journal of Microbiology Immunology and Infection 71, pp
567–570.
49. Hu D.L., Zhu G., Mori F., Omoe K., Okada M., Wakabayashi K., Kaneko S., Shinagawa K., Nakane A. (2007), Enterotoxin Induces Emesis Through Increasing
Serotonin Release in Intestine and It Is Downregulated by Cannabinoid Receptor 1, Cellular Microbiology 9, pp 2267–2277.
50. Hu D.L., Omoe K., Sashinami H., Shinagawa K., Nakane A. (2009), “Immunization with a Nontoxic Mutant of Staphylococcal Enterotoxin A, SEAD227A, Protects Against Enterotoxin-Induced Emesis in House Musk Shrews”, Journal of Infectious Diseases 199, pp 302–310.
51. Jenny Schelin, Nina wallin-Carlquist, Marianne Thorup Cohn, Roland Lindqvist, Gary C. Barker and Peter rådström (2011), “The formation of Staphylococcus aureus enterotoxin in food environments and advances in risk assessment”, Virulence Journal 2 (6), pp 580-592.
52. Jennifer Kovacs-Nolan and Yoshinori Mine (2012), “Egg Yolk Antibodies for Passvie Immunity”, Annual Review of Food Science and Technology 3, pp 163- 182.
53. Jeremy M Berg, John L Tymoczko and Lubert Stryey (2002), Biochemistry, 5th
edition, W.H Freeman, New York.
54. Jhalka Kadariya, Tara C. Smith and Dipendra Thapaliy (2014), Staphylococcus aureus and Staphylococcal Food-Borne Disease: An Ongoing Challenge in Public Health, BioMed Research International, Hindawi Publishing Corporation.
55. Joseph F. Metzger, Anna D. Johnson, William S. Collins II and Virginia McGann (1973), “Staphylococcusaureus Enterotoxin B release (excretion) under controlled condition of fermentation”, Journal of Applied Microbiology 25(5), pp 770-773.
56. Kenneth Todar, Todar’s Online Textbook of Bacteriology University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology (Staphylococcus), Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2005. <http://www.textbookofbacteriology.net/staph.html>
57. Kerouanton A., Hennekinne J.A., Letertre C., Petit L., Chesneau O., Brisabois A., DeBuyser M.L. (2007), “Characterization of Staphylococcus aureus strains
associatedwith food poisoning outbreaks in France”, International Journal of Food Microbiology 115, pp 369–375.
58. Koets M., Sander I., Bogdanovic J., Doekes G., Van Amerongen A.(2006), A rapid lateral flow immunoassay for the detection of fungal alpha-amylase at the workplace, Journal of Environmental Monitoring 8 (2006) 942-6.
59. Leenaars M. and Hendriksen C.F (2005), “Criticalsteps intheproduction of polyclonaland monoclonal antibodies:evaluationand recommendations”, ILAR Journal 46, pp 269-279.
60. Ler S.G., Lee F.K., Gopalakrishnakone P. (2006), “Trends in Detection of Warfare Agents. Detection Methods for Ricin, Staphylococcal Enterotoxin B and T-2”, Journal of Chromatography A1133, pp 1–12.
61. Liben Chen, Shuang Li, Zhengfang Wang, Ruilong Chang, Jingliang Su and Bo Han (2012), “Protective effect of recombinant staphylococcal enterotoxin A entrapped in polylactic-co-glycolic acid microspheres against Staphylococcus aureus infection”, Veterinary Research 43 (20), pp 1-11.
62. Lívia Silveira Munhoz, Gilberto D’Ávila Vargas, Geferson Fischer, Marcelo de Lima, Paulo Augusto Esteves, Silvia de Oliveira Hübner (2014), “Avian IgY antibodies: characteristics and applications in immunodiagnostic”, Ciência Rural 44 (1), pp 153-160.
63. Marrack P., Kappler J. (1990), “The staphylococcal enterotoxins and their relatives”, Science 248, pp 705-711.
64. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha (2010), “Staphylococcal enterotoxins: Molecular aspects and detection methods”, Journal of Public Health and Epidemiology 2, pp 29-42.
65. María Ángeles Argudín, María Carmen Mendoza and María Rosario Rodicio (2010), “Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins”, Toxins 2, pp
1751-1773.
66. McCormick JK, Yarwood JM, Schlievert PM (2001), “Toxic shock syndrome and bacterial superantigens: an update”, Annual Review of Microbiology 55, pp
77-104.
67. Miethke T, Wahl C, Heeg K, Echtenacher B, Krammer PH, Wagner H (1992), “T cell-mediated lethal shock triggered in mice by the superantigen staphylococcal enterotoxin B”, Critical role of tumor necrosis factor. Journal of Experimental
Medicine 175, pp 91-98.
68. Márta D, Wallin-Carlquist N, Schelin J, Borch E, Radstrom P. (2011), “Extended staphylococcal enterotoxin D expression in ham products”, International Journal
of Food Microbiology 28, pp 617–620.
69. Mead PS, Slutsket L., Dietz V., McCaig LF., Bresee JS., Shapiro C., Griffin PM., Tauxe RV. (1999), “Food-related illness and death in the United States”,
Emerging Infectious Diseases Journal 5, pp 607-25.
70. Merlin S. Bergdoll and Amy C. Lee Wong (2006), “Staphylococcal intoxication”, Foodborne Infection and Intoxications, pp 523-551.