Phƣơng
pháp 1000 300 100 Nồng độ độc tố SEE (ng/ml) 30 10 3 1 0
Que thử + + + + + - - -
Hình 3.22. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE
8: mẫu âm tính khơng chứa SEE.
Tƣơng tự nhƣ với SEC1, {tc "III.5.3.1. Xác đ?nh đ? nh?y phát hi?n c?a que th? v?i SEA" \f C \l 4}các kết quả phân tích với kháng nguyên SEE ở Bảng 3.5 và Hình 3.22 cho thấy giới hạn phát hiện của que thử với độc tố ruột tụ cầu SEE là 10ng/ml ở trong phịng thí nghiệm (que thử số 5).
Từ kết quả sau khi phân tích que thử bằng các độc tố ruột SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trong đệm chạy, chúng tơi có thể kết luận giới hạn phát hiện của que thử với các độc tố ruột SEA, SEB, SEC1, SED và SEE nhƣ sau: Với các độc tố SEA, SEB và SED giới hạn phát hiện của que thử khoảng 30 ng/ml; với SEC1 và SEE giới hạn phát hiện của que thử là 10 ng/ml.
Kết quả giới hạn phát hiện của que thử trong luận án này phát hiện nồng độ độc tố cao hơn so với của que thử SEB trong nghiên cứu của Boyle 2009 (0,25ng/ml) [20] và so với của que thử SEA trong nghiên cứu của Keiko Yamada năm 2013 (0,2ng/ml) [109]. Tuy nhiên, que thử trong cả hai nghiên cứu này đều ứng dụng nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi để phát hiện độc tố ruột của tụ cầu, theo đó độc tố đƣợc nhận ra bởi hai kháng thể là kháng thể phát hiện (kháng thể cộng hợp) và kháng thể bắt cặp (trên vạch thử nghiệm). Ngƣợc lại, que thử của chúng tôi ứng dụng nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để phát hiện độc tố ruột của tụ cầu, theo đó độc tố chỉ đƣợc nhận ra bởi một loại kháng thể trên vạch thử nghiệm nên que thử có giới hạn phát hiện nồng độ độc tố cao hơn.
Bên cạnh đó, khi so sánh ngƣỡng phát hiện của hai loại que thử cùng ứng dụng nguyên lý sắc ký miễn dịch cạnh tranh, là que thử phát hiện nhanh một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) nói trên với kháng thể vạch thử nghiệm là IgY kháng một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) do chúng tôi sản xuất với que thử phát hiện SEA sử dụng kháng thể IgG thỏ kháng SEA mua của hãng Abcam [4], cho thấy giới hạn phát hiện của que thử tạo ra trong đề tài luận án là cao hơn gần 3 lần so với que thử phát hiện độc tố SEA ( 80ng/ml) [4]. Điều này cho thấy kháng thể IgY mà chúng tơi thu đƣợc có hoạt tính kháng thể cao, có phản ứng mạnh với các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE).
3.3.2.2. Xác định tính ổn định của que thử
Que thử phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE đƣợc bảo quản ở các điều điều kiện nhiệt độ khác nhau trong phịng thí nghiệm: ở nhiệt độ 25oC và ở 4oC nhằm xác định tính ổn định của que thử và đƣa ra các điều kiện bảo quản trên thực tế ở nƣớc ta. Sau 6 tháng bảo quản, định kỳ tiến hành đánh giá theo các mức thời gian ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Tính ổn định của que thử phát hiện SE(A+B+C1+D+E)
Que thử Thời gian
1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng
25oC + + + + + +
4oC + + + + + +
Kết quả (bảng 3.1) cho thấy trong các điều kiện bảo quản ở nhiệt độ 25oC và ở 4oC, que thử vẫn giữ nguyên đƣợc hiệu giá phát hiện các độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE sau thời gian lƣu giữ. Tuy nhiên, thời gian lƣu giữ que thử cho đến thời điểm bản luận án này đƣợc viết là 6 tháng. Thông thƣờng, thời gian bảo quản của que thử sắc ký miễn dịch là từ 12 – 24 tháng ở nhiệt độ thƣờng [88]. Do đó, nghiên cứu về các điều kiện bảo quản với thời gian kéo dài hơn là cần thiết để có đƣợc các thơng tin đầy đủ hơn về độ ổn định của que thử.
3.4. SỬ DỤNG QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU TRÊN THỰC PHẨM ĐƢỢC GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM
3.4.1. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên sữa đƣợc gây nhiễm thực nghiệm SED và SEE) trên sữa đƣợc gây nhiễm thực nghiệm
Hình 3.23. Lựa chọn nồng độ sữa pha loãng cần sử dụng
1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 và 10: Độ pha loãng sữa sử dụng cho 1 phản ứng là 1; 2; 3; 4; 5; 6 ; 7; 8; và 10 lần.
Để sữa có thể chảy đƣợc nhờ lực mao dẫn của que thử chỉ cần pha lỗng mà khơng cần bất cứ một quá trình tiền xử lý nào với mẫu. Để tối ƣu hóa đƣợc mức độ pha lỗng sữa dùng cho thử nghiệm, chúng tơi tiến hành pha lỗng ở các mức độ 1; 2; 3; 4; 5 ; 6 ; 7; 8; 9 và 10 lần trong dung dịch đệm chạy Kết quả chỉ ra rằng sữa đƣợc pha loãng 3 lần trong đệm chạy là mức độ pha loãng sữa thấp nhất cho thấy rõ tín hiệu ở cả vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng trên que thử (que thử số 3, Hình 3.23), đồng thời tốc độ dòng chảy của thử nghiệm là phù hợp. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo, độ lỗng này đƣợc sử dụng khi đánh giá que thử bằng mẫu sữa.
Kích thƣớc lỗ của màng đƣợc sử dụng trong HTSKMD là khoảng từ 8 đến 15 µm [88]. Việc đồng nhất mẫu không tốt và nồng độ các hạt nhỏ trong mẫu quá cao sẽ lấp lỗ mao dẫn của màng hút mẫu, thời gian cho kết quả của que thử sẽ chậm. Do đó, cần phải pha lỗng mẫu sữa với các nồng độ khác nhau để tìm ra nồng độ phù hợp cho phản ứng của que thử. Trong nghiên cứu của Boyle, các mẫu sữa chua, kem và các sản phẩm sữa có chất làm đặc cũng đƣợc pha loãng từ 1:4 đến 1: 20 trong đệm PBS, pH 7,2 [20].
3.4.1.2. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên sữa được gây nhiễm thực nghiệm và SEE) trên sữa được gây nhiễm thực nghiệm
Vì mẫu sữa đƣợc sử dụng làm thí nghiệm là mẫu sữa đã pha loãng ba lần nên nồng độ độc tố bổ sung vào những mẫu phân tích này cũng phải đƣợc tăng lên gấp 3 lần để đảm bảo mẫu sữa tiến hành thí nghiệm đƣợc bổ sung hàm lƣợng độc tố giống nhƣ khi thử trong đệm chạy. Tiến hành nhiễm chủ động các nồng độ kháng nguyên SEA; SEB; SEC1; SED và SEE tinh khiết đã đƣợc pha loãng với các nồng độ 3000 ng/ml, 900 ng/ml, 300 ng/ml, 90 ng/ml, 30
ng/ml, 9 ng/ml và 3 ng/ml vào sữa và sau đó xác định giới hạn phát hiện của các que thử trong mẫu sữa.
Xác định giới hạn phát hiện SEA trên sữa