1.1 .TỤ CẦU KHUẨN
1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU
Khi phát triển các kỹ thuật phát hiện SE, cần thiết phải có kháng nguyên tinh khiết là các SE phục vụ cho việc sản xuất kháng thể và phát triển bộ sinh phẩm. SE có thể đƣợc sản xuất bởi các cách: thu nhận trực tiếp từ S.aureus và thu nhận qua con
đƣờng tái tổ hợp và tinh chế SE.
1.6.1. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu trực tiếp từ S. aureus
Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu để sản xuất các SE trực tiếp từ S. aureus.
Một nghiên cứu của Edward J. Schantz và cộng sự cho thấy độc tố SEB đƣợc thu nhận trực tiếp từ môi trƣờng nuôi cấy của S. aureus và tinh sạch bằng sắc ký trên màng carboxylmethyl - cellulose [37]. Năm 1967, với phƣơng pháp sắc ký trên cột CM- cellulose và phƣơng pháp mới khi áp dụng gel lọc Sephadex G-75 và G-50, Concordia R.Bojia và Merlin S. Berdoll đã thu đƣợc độc tố SEC [27]. Năm 1979, Chang HC, Bergdoll MS đã kết hợp 2 phƣơng pháp tinh sạch bằng sắc ký trên màng carboxylmethyl- cellulose và áp dụng cột lọc Sephadex G-75 để thu đƣợc SED [24]. Các nghiên cứu sản xuất độc tố ruột tụ cầu trực tiếp từ S.aureus đã sản xuất ra ít nhất 12 loại độc tố ruột tụ cầu nhƣ sau: SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL và SEM [70].
Tùy theo mục tiêu sản xuất, dụng cụ, hóa chất có sẵn và điều kiện sản xuất, ngƣời ta đã tiến hành sản xuất các SE theo quy mô nhỏ hay quy mô lớn.
* Quy mô nhỏ: Sản xuất các SE quy mơ nhỏ có những phƣơng pháp nhƣ ni trên thạch rắn, nuôi trên thạch bán rắn, nuôi lắc trong bình tam giác và ni trong túi [70]. Các phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất và tinh sạch một lƣợng nhỏ độc tố để phân lập dòng vi khuẩn tạo các SE. Phƣơng pháp nuôi trên thạch rắn là phƣơng pháp đơn giản để nuôi các chủng tụ cầu tạo SE nhằm phân loại các chủng tạo độc tố tụ cầu. Robbins năm 1974 đã nuôi S. aureus trên môi trƣờng thạch bán rắn ở đĩa Petri [94]. Bên cạnh đó, nhiều độc tố đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp ni lắc vi khuẩn trong bình tam giác và thu đƣợc sản lƣợng độc tố SEA, SED và SEE tăng gấp 10 lần so với các phƣơng pháp thơng thƣờng, trong khi đó độc tố SEB và SEC tăng ít hơn (gấp 2 lần). Với phƣơng pháp nuôi trong túi, môi trƣờng đƣợc đặt trong túi thẩm tích và đặt ở đáy bình tam giác, 20ml dịch chứa tế bào đƣợc thêm vào, thời gian nuôi
cấy là 24 giờ, lắc ở tốc độ vừa phải để dịch ni cấy đƣợc trộn đều trong túi thẩm tích. Mơi trƣờng canh thang BHI (Brain heart infusion) thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất SE, đặc biệt ở quy mô nhỏ [70].
* Quy mô lớn: Thông thƣờng, sự sản xuất SE ở quy mô lớn đƣợc thực hiện
trong bình tam giác hoặc các bình tƣơng tự với phƣơng pháp lắc, hoặc trong q trình lên men. Các kích cỡ của bình chứa mơi trƣờng lên men là khác nhau, các bình có kích thƣớc 0,5 - 2000 lít thƣờng đƣợc sử dụng cho quá trình sản xuất SE này. Metzger và cộng sự (1973) đã sản xuất đƣợc một lƣợng lớn độc tố SEB (lên đến 600 µg) trong một thể tích 50 lít mơi trƣờng lên men [55]. Carpenter (1974) đã sản xuất đƣợc một lƣợng tƣơng đƣơng SEB trong 0,5 lít mơi trƣờng ni cấy ở bình 1 lít [30]. Jarvis (1973) đã sản xuất đƣợc nhiều độc tố SEA trong 2 lít ở mơi trƣờng lên men nhiều hơn so với trong bình lắc. Ngƣợc lại, với SEB và SEC thì thu đƣợc ở mơi trƣờng lên men là ít hơn [17]. Nồng độ ơ xy hịa tan có ảnh hƣởng đến sự sản xuất SEC: Carpenter và Silverman (1974) đã phát hiện ra rằng ở mức 10-50% lƣợng oxy hịa tan thì SEB đƣợc sản xuất nhiều hơn so với ở mức 0% hoặc 100%. Năm 1973, Metzger và các cộng sự đã tìm ra một phƣơng pháp tối ƣu về điều kiện môi trƣờng để tạo sản lƣợng SE cao, bằng cách thêm cao nấm men vào môi trƣờng nuôi cấy [55]. Các độc tố SEA và SEB đã đƣợc tạo ra với một sản lƣợng cao hơn sau khi bổ sung 1% cao men, 0,2% glucose và 4% NZA-A với các mức lần lƣợt là hơn 100µg/ml của SEA và hơn 400µg/ml SEB [70].
1.6.2. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu bằng phƣơng pháp tái tổ hợp
Các điều kiện ni cấy S. aureus nhằm kích thích tạo các SE đã đƣợc làm sáng tỏ. Tuy nhiên, việc tinh sạch các SE thƣờng rất phức tạp, gồm nhiều công đoạn do phải loại bỏ hồn tồn protein A vốn có khả năng liên kết với các dạng IgG. Sản xuất các SE theo con đƣờng tái tổ hợp giúp khắc phục các nhƣợc điểm đã nêu ở trên. Trong trƣờng hợp một hỗn hợp của các protein chƣa biết hoặc một chiết xuất tế bào đã biết, có nhiều cách khác nhau để chọn các bƣớc tinh sạch tối thiểu và hiệu quả nhất nhằm đạt đƣợc độ tinh sạch mong muốn (ví dụ 98%, 99,5% hoặc 99,9%) [15]. Để protein tái tổ hợp đạt đƣợc độ tinh sạch cao dùng cho phân tích hoặc điều trị, một số kỹ thuật sắc
ký có thể đƣợc sử dụng: sắc ký trao đổi ion, sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc, lọc gel và sắc ký ái lực [108].
Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam đã sản xuất các SE, gồm: SEA, SEB, SEC, SED, SEE tái tổ hợp [4, 6, 61, 72, 109]. Khi sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, có thể sản xuất SE trong tế bào khả biến Escherichia coli không sinh protein A. Đồng thời, khi sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, chúng ta có thể tạo ra các SE dƣới dạng dung hợp với các đuôi ái lực, độc tố tái tổ hợp sẽ nối thêm 6 acid amin Histidin (đuôi His); hoặc nối thêm glutathione-S-transferase (đuôi GST). Các kỹ thuật DNA tái tổ hợp này sẽ cho phép đơn giản hóa quy trình tinh sạch đi rất nhiều. Ví dụ, đi His có ái lực cao với Ni2+ do có vịng thơm imidazole, vì thế protein dung hợp với đuôi His đƣợc giữ lại trên cột sắc ký chứa các hạt resin có gắn Ni2+, cịn những protein không mong muốn sẽ ra khỏi cột này. Nhƣ vậy, sắc ký ái lực có thể cho phép thu protein đích bằng một bƣớc duy nhất, với độ tinh sạch cao.
Năm 2012, Liben Chen và các cộng sự đã tách dòng gen sea từ S. aureus, thiết
kế thành công vec tơ biểu hiện pGEX-sea và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli
BL21. SEA tái tổ hợp ở dạng dung hợp với đi GST có khối lƣợng phân tử khoảng 56 kDa đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực có độ tinh sạch cao, để sản xuất vaccin chống SE [61].
Năm 2013, Wangchun Jin và các cộng sự đã sản xuất đƣợc các SEA, SEB, SEC, SED và SEE tái tổ hợp với đuôi His để làm các kháng nguyên cho sản xuất kháng thể IgY ở gà. Nghiên cứu này sử dụng vector pQE30 và chủng E. coli XL1-
Blue để biểu hiện các gen SE, các SE tái tổ hợp trên đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực với cột gắn Ni2+ [109].
Đầu năm 2014, Nandita P. Agnihotri đã công bố sản xuất SEC2 tái tổ hợp với đuôi His sử dụng vector biểu hiện pQE30Xa và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli SG13009, tạo ra protein tƣơng ứng với khối lƣợng khoảng 29,7 kDa [72]. Protein tái tổ hợp đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực với cột gắn Ni2+ và đƣợc sử dụng để tạo kháng thể trên thỏ.
Trong nghiên cứu của Nghiêm Ngọc Minh (2011) đã tiến hành tách dòng gen
seb từ S. aureus bằng vector tách dòng pJet, thiết kế thành công vector biểu hiện
pET21a+ mang gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB dạng tự nhiên có độc tính và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21. Protein tái tổ hợp SEB có đi His, khối lƣợng 28 kDa đƣợc tinh sạch thành công bằng cột Nikel Resin sẽ phục vụ làm nguyên liệu tạo SEB tái tổ hợp ở dạng đột biến khơng có độc tính, làm nguyên liệu cho việc tạo Kit phát hiện nhanh NĐTP do SE [6].
Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tơi cũng đã sản xuất thành công độc tố SEA tái tổ hợp để làm nguyên liệu tạo que thử SEA bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh . Protein SEA tái tổ hợp đã đƣợc tạo ra ở trạng thái dung hợp với glutathione-S-transferase (GST) có khối lƣợng khoảng 53 kDa nhờ biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 mang plasmid pGEX-6P-1-sea và đƣơ ̣c tinh sạch bằng sắc ký ái lƣ̣c sƣ̉ du ̣ng bộ kit GST SpinTrap [4].
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid
- Chủng Staphylococcus aureus P240 mang gen độc tố sec1 phân lập từ sữa, đƣợc cung cấp bởi phòng Vi sinh, Viện Dinh dƣỡng Quốc gia, chủng đƣợc tham chiếu thƣờng xuyên với chủng chuẩn S.aureus ATCC29213.
- Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng BL21 (SHuffle® T7 Express Competent E. coli, C3030) (New England Biolab, Mỹ) sử dụng cho mục đích biểu
hiện protein SEC1.
- Vector biểu hiện pGS-21a có kích thƣớc 6169 bp [T7-P, GST-tag, His-tag, Amp] (Genescript, Mỹ).
Hình 2.1. Sơ đồ vector biểu hiện pGS-21a
- Các độc tố ruột của tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE chuẩn của hãng
2.1.2. Động vật thí nghiệm
Gà mái dòng thuần Leghorn trắng, 1 ngày tuổi, gồm 30 con, cân nặng 35- 40g/con, mua từ Công ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì, ni tại Hải Dƣơng.
2.1.3. Thực phẩm thử nghiệm
Một số mẫu thực phẩm thu thập tại địa bàn Hà Nội bao gồm:
- Sữa tƣơi tiệt trùng không đƣờng, thành phần dinh dƣỡng trong 100ml gồm chất đạm: 2,9 g; chất béo: 3,3 g; hydratcarbon: 4,7g, hỗn hợp các vitamin và khoáng chất. Mẫu thu thập ngày 15 tháng 8 năm 2014, 1 lốc gồm 4 hộp.
- Thịt lợn: Mẫu thịt nạc vai đƣợc thu thập trong khoảng thời gian 6h đến 6h30 sáng, chọn thịt cómàu hồng tƣơi, thớ thịt mịn đều, da mỏng, lớp mỡ có màu sáng bóng, có độ rắn. Mẫu đƣợc thu thập là 200g, ngày 5 tháng 9 năm 2014.