1.1 .TỤ CẦU KHUẨN
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.1. Gây miễn dịch
Gà đƣợc gây miễn dịch để sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng BSA và kháng thể đa dòng IgY kháng các đ ộc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) theo quy trình sản xuất kháng thể IgY của Agro-Bio 2011 [11].
* Chuẩn bị gà để làm thực nghiệm
Gà mái thuộc giống gà Leghorn trắng, 1 ngày tuổi gồm 30 con, cân nặng 35- 40g/con, mua từ Cơng ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì, đƣợc ni tại Hải Dƣơng trong cùng điều kiện đầy đủ thức ăn, nƣớc uống, thời gian chiếu sáng 12/24 giờ bằng ánh sáng tự nhiên. Hàng ngày chuồng nuôi gà đƣợc vệ sinh, gà đƣợc ăn uống và theo dõi tình trạng sức khỏe. Trong q trình ni, gà khơng ốm và không dùng kháng sinh. Khi gà bắt đầu đẻ trứng ở tuần 18, chọn ra những con gà có các đặc điểm tốt cho việc đẻ trứng (vóc dáng cân đối, khơng dị tật ở mỏ, ngón chân, mồng, tích phát triển lớn, màu đỏ tƣơi, lơng óng mƣợt, cánh ép sát vào thân) để theo dõi tình trạng đẻ trứng. Sau đó, lựa chọn 6 con gà này đẻ trứng đều trong hai tuần đầu, trọng lƣợng trứng khoảng 50-60g, vỏ trứng có màu trắng, phớt hồng sử dụng cho việc gây miễn dịch, sản xuất kháng thể IgY.
- Lô 1 (2 con): gây miễn dịch với hỗn hợp kháng nguyên SEA, SEB, SEC1, SED và SEE để tạo kháng thể đa dòng IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E).
- Lô 2 (2 con): gây miễn dịch với protein BSA (Sigma) để tạo kháng thể đa dòng IgY kháng BSA.
- Lơ 3 (2 con): là nhóm đối chứng, đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý 0,9%.
* Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên gây miễn dịch cho gà
- Để gây miễn dịch cho mỗi con gà với BSA, thành phần hỗn hợp kháng nguyên BSA đƣợc chuẩn bị nhƣ sau:
Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên BSA
Ống Kháng nguyên BSA (ml) Tá dƣợc FCA (ml) Tá dƣợc FIA (ml) Nồng độ (mg/ml) 1 1 1 0 1 2 1 0 1 1 3 1 0 1 1
Dung dịch BSA nồng độ 2mg/ml trộn với tá dƣợc Freund hoàn toàn (FCA) theo tỷ lệ 1:1 ở lần tiêm đầu tiên. Dung dịch BSA nồng độ 2mg/ml đƣợc trộn với tá dƣợc Freund khơng hồn tồn (FIA) với tỷ lệ 1:1 ở 2 lần tiêm nhắc lại.
- Để gây miễn dịch cho mỗi con gà với kháng nguyên là các độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED, SEE, kháng nguyên đƣợc chuẩn bị với thành phần nhƣ sau:
Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên các SE Ống Kháng nguyên Ống Kháng nguyên SE (A-E) (µl) Nƣớc muối sinh lý(µl) Tá dƣợc FCA (µl) Tá dƣợc FIA (µl) Nồng độ (ng/ml) 1 100 400 500 0 100 2 100 400 0 500 100
- Các độc tố ruột của tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE chuẩn đƣợc mua từ hãng Toxin Technology. Tất cả các độc tố đều đƣợc nhận dƣới dạng bột, bảo quản ở - 20oC cho đến khi hoàn nguyên bằng cách thêm nƣớc loại ion vơ trùng với dung dịch
ban đầu có nồng độ 100µg/ml. Các dung dịch độc tố này đƣợc pha lỗng cao hơn bằng cách sử dụng dung dịch PBS 0,1M, pH 7,2.
- Hỗn hợp kháng nguyên SEA, SEB, SEC1, SED và SEE với nồng độ 20 ng/ mỗi loại độc tố đƣợc pha trong nƣớc muối sinh lý và trộn theo tỷ lệ thể tích 1:1 với tá dƣợc FCA ở lần tiêm đầu tiên, và với tá dƣợc FIA ở lần tiêm nhắc lại. Chuẩn bị các ống kháng nguyên bằng việc lần lƣợt thêm các thành phần nhƣ ở Bảng 2.3 hoặc Bảng 2.4, sau đó trộn đều tạo thành dịch đồng nhất kháng nguyên để gây miễn dịch cho gà.
* Đường tiêm và khoảng thời gian giữa các lần tiêm
Gà Lerhorn trắng 20 tuần tuổi đƣợc tiêm theo đƣờng tiêm bắp ở 2 vị trí: bên trái và bên phải cơ ngực, tiêm 0,5 ml kháng nguyên/một vị trí. Với kháng nguyên là BSA số lần tiêm là 3 lần (lần đầu tiên và 2 lần tiêm nhắc lại) còn với độc tố ruột tụ cầu số lần tiêm là 2 lần (lần đầu tiêm và lần tiêm nhắc lại). Khoảng thời gian giữa hai lần tiêm là 2 tuần.
* Thu trứng gà
Trong nghiên cứu này, trứng đƣợc thu từ ngày thứ 12 sau lần tiêm nhắc lại và tiếp tục thu trứng trong 14 ngày sau với lô gà tiêm kháng nguyên là các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE). Bên cạnh đó, với lơ gà tiêm kháng nguyên là BSA thu trứng từ ngày thứ 12 sau khi tiêm nhắc lại lần thứ nhất và tiếp tục thu trứng cho đến sau khi tiêm mũi nhắc lại lần thứ 2 đƣợc 14 ngày. Đây là khoảng thời gian gà đẻ những quả trứng có nồng độ kháng thể IgY đặc hiệu cao. Những quả trứng này đƣợc sử dụng cho quá trình tinh sạch IgY. Từng quả trứng đƣợc ghi số con gà và ngày đẻ, sau đó đƣợc bảo quản ở 4o C cho đến khi sử dụng.