Phƣơng pháp sản xuất độc tố ruột tụ cầu SEC1 tái tổ hợp

1.1 .TỤ CẦU KHUẨN

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp sản xuất độc tố ruột tụ cầu SEC1 tái tổ hợp

Các bƣớc trong quy trình tạo độc tố ruột SEC1 tái tổ hợp đƣợc tóm tắt trong sơ đồ ở Hình 2.2 dƣới đây:

Vi khuẩn Staphylococcus aureus mang gen sec1 đƣợc nuôi tăng sinh trong canh

trƣờng BHI, ủ ở 37oC, 18 giờ. Tách chiết DNA tổng số dựa vào việc phá vỡ cấu trúc thành tế bào của S. aureus với quá trình tách chiết đƣợc thƣ̣c hiê ̣n nhƣ sau: Ly tâm 2ml huyền dịch S. aureus trong canh trƣờng BHI ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Sinh khối vi khuẩn đƣợc hịa tan trong 500µl dung dịch đệm TE bằng máy vortex. Thêm vào ống 50 µl dung dịch lyzozyme (10mg/ml), ủ ở 30oC trong 30 phút. Sau đó, thêm vào ống 30µl dung dịch SDS 10%, thêm tiếp 20 µl proteinase K và ủ ở 37oC trong 30 phút. Tiếp theo, thêm vào ống 100µl dung dịch NaCl 5M, tiếp tục thêm 80µl dung dịch NaCl 0,7M và ủ ở 65oC trong 10 phút rồi làm nguội ở nhiệt độ phòng. Bổ sung vào ống 800µl CIA (24 chloroform:1 isoamyl alcohol), trộn đều và ly tâm 1 phút ở 10.000 vịng/phút. Hút 500µl dịch nổi vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm vào ống 500 µl isopropanol, đảo trộn đều và quan sát tủa DNA. Dùng pipet hút sợi DNA vào ống có chứa 1000µl ethanol 70%, vortex và ly tâm 10.000 vòng/phút. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, dùng pipet hút tồn bộ dịch cịn sót lại ra khỏi ống, làm khơ ống và hịa tan kết tủa DNA trong 50µl nƣớc cất, ủ ở 55oC trong 5 phút. Nồng độ DNA đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 260/280 và chất lƣợng DNA đƣợc kiểm tra bằng cách điện di 10µl mẫu thu đƣợc trên gel agarose 0,8%.

2.3.1.2. Khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR

DNA của vùng gen sec1 đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR, thành phần của một phản ứng PCR thể tích 50 µl nhƣ sau: 5 µl dung dịch đệm PCR 10X, 4 µl dNTP (2.5 mmol/µl), 0,5 µl Taq DNA polymerase, 1 µl mồi xi (10 pmol/µl), 1 µl mồi ngƣợc (10 pmol/µl), 2µl DNA khn (100ng/µl), 36,5 µl nƣớc khử ion vơ trùng.

Chu trình nhiệt: DNA hệ gen bị biến tính ở 95°C, 4 phút, q trình nhân bản với 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc đƣợc thực hiện là biến tính ở 95°C, 30 giây, bắt cặp mồi ở 55°C, 30 giây và kéo dài chuỗi ở 72°C, 1 phút. Phản ứng kết thúc ở 72°C, 5 phút.

Sản phẩm PCR sau khi tổng hợp đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% trong 30 phút ở hiệu điện thế 100V, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium

brommide trong 10 phút. Chụp ảnh để ghi lại kết quả điện di bằng hệ thống máy soi gel.

2.3.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch GeneJET (Thermo Scientific) gồm các bƣớc nhƣ sau: Sau khi xác định đoạn DNA cần tách trên bản gel điện di, cắt mảnh gel chứa đoạn này cho vào ống 1,5 ml và cân xác định khối lƣợng gel. Thêm đệm B (Binding buffer) vào ống với tỷ lệ (1thể tích đệm B: 1 khối lƣợng gel), ủ ở 60oC trong 10 phút để mảnh gel tan hoàn toàn. Chuyển toàn bộ hỗn hợp trên vào cột GeneJET, ly tâm tốc độ 12000 g trong 1 phút, ở 4oC để loại bỏ hoàn toàn cặn của gel điện di. Rửa cột bằng 700 µl đệm W (Washing buffer), ly tâm ở tốc độ 12000 vịng/phút trong 1 phút. Hút 500µl dịch nổi vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm vào ống 500 µl isopropanol, đảo trộn đều và quan sát tủa DNA. Dùng pipet hút sợi DNA vào ống có chứa 1000µl ethanol 70%, vortex và ly tâm 10000g. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, hút tồn bộ dịch cịn sót lại ra khỏi ống, làm khơ ống và hịa tan kết tủa DNA trong 50µl nƣớc cất, ủ ở 55oC trong 5 phút. Nồng độ DNA đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 260/280 và chất lƣợng DNA đƣợc kiểm tra bằng cách điện di 10µl mẫu thu đƣợc trên gel agarose 0,8%.

2.3.1.4. Xây dựng vector biểu hiện mang gen sec1

Để thiết kế vector biểu hiện, đoạn gen sec1 (sản phẩm PCR sau khi tinh sạch) đƣợc cắt bằng enzym giới hạn là BamHI và HindIII tạo các liên kết đầu dính phù hợp

với vector biểu hiện là pGS-21a đã đƣợc mở vòng , sau đó ghép nối với nhau bằng T4 DNA ligase tạo pGS-21a-sec1.

* Cắt đoạn gen sec1 và plasmid pGS-21a bằng enzym giới hạn

Gen sec1 (sản phẩm PCR sau khi tinh sạch) và plasmid pGS-21a đƣợc cắt bằng enzym giới hạn là BamHI và HindIII. Phản ứng cắt với enzym giới hạn có thể tích 50 µl, bao gồm thành phần các chất tham gia nhƣ sau: 5 µl dung dịch đệm, 2 µl BamHI, 2 µl HindIII, 35 µl DNA, 6 µl nƣớc khử ion vơ trùng. Phản ứng đƣợc ủ ở 37oC trong 30 phút, sau đó ủ ở 80oC trong 10 phút để bất hoạt enzym. Sản phẩm cắt đƣợc tinh sa ̣ch

bằng kit GeneJET (Thermo Scientific) và kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%.

* Nối gen sec1 vào vector pGS-21a

Đoạn gen sec1 đƣợc nối vào vector pGS-21a bằng T4 DNA ligase kit (New England Biolabs). Thành phần và thể tích hỗn hợp tham gia vào phản ứng nhƣ sau: 1 µl đệm T4 ligase, 5 µl đoạn gen cần gắn, 5 µl vector đã mở vịng, 1 µl T4 ligase, 8 µl nƣớc khử ion vơ trùng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4-8oC qua đêm. Sau đó sử dụng 5µl sản phẩm phản ứng để biến nạp vào 100 µl tế bào E. coli khả biến.

2.3.1.5. Biến nạp plasmid pGS-21a-sec1 vào tế bào E. coli BL 21

Plasmid pGS-21a-sec1, mang gen mã hóa SEC1 dạng dung hợp với đuôi His- GST, đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 (New England Biolabs) bằng

phƣơng pháp sốc nhiệt theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau: Rã đông một ống tế bào khả biến E. coli BL21 trong đá trong 10 phút. Thêm 2µl plasmid pGS-21a (20ng DNA plasmid) vào ống chứa tế bào khả biến, trộn đều và ủ trong đá 30 phút. Sốc nhiệt ở 42oC trong 10 giây, ủ đá trong 5 phút. Thêm 950µl mơi trƣờng SOC vào ống và ủ ở 37oC trong 60 phút, lắc 150 vịng/phút. Cấy trải 50, 100, 200 µl lên bề mặt thạch LB có bổ sung 100mg/l ampicillin và ủ qua đêm ở 37oC. Kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR.

- Kiểm tra đoạn gen biến nạp + Kỹ thuật PCR colony

Để kiểm tra về sự có mặt của đoạn gen sec1 trong plasmid của tế bào biểu hiện protein E. coli BL21, từ kết quả cấy trải các tế bào đã biến nạp trên mơi trƣờng thạch LB có bổ sung ampicillin, chọn 5 khuẩn lạc đặc trƣng để nuôi tăng sinh trong môi trƣờng LB lỏng có ampicillin, mỗi chủng ni trong 3ml mơi trƣờng qua đêm ở 30oC, lắc 150 vòng/phút. Các dòng vi khuẩn đƣợc sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuếch đại gen mục tiêu sec1 với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đƣợc thực hiện nhƣ ở mục 2.3.1.2 để tìm khuẩn lạc mang vector pGS-21a-sec1.

Các khuẩn lạc mang plasmid pGS-21a-sec1 đã đƣợc sàng lọc bằng phản ứng PCR đƣợc nuôi cấy trong mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin. Sau đó, DNA của những plasmid tái tổ hợp đƣợc tách chiết và tinh sạch theo Kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System với quy trình của nhà cung cấp. Plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt bằng các enzyme giới hạn là BamHI và HindIII. Thành phần phản ứng

cắt với enzym giới hạn có thể tích 50 µl nhƣ sau: 5 µl dung dịch đệm, 2 µl BamHI, 2 µl HindIII, 35 µl DNA, 6 µl nƣớc khử ion vơ trùng. Phản ứng đƣợc ủ ở 37oC trong 30 phút, sau đó ủ ở 80oC trong 10 phút để bất hoạt enzym. Sản phẩm cắt (gen sec1) đƣợc tinh sa ̣ch và ki ểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. DNA của plasmid đƣợc chuẩn bị với cặp mồi T7 promoter + T7 terminator và đem gửi công ty VnDat Co. Ltd để giải trình tự ở cơng ty 1st Base Selangor, Malaysia.

2.3.1.6. Biểu hiện protein SEC1 tái tổ hợp

Để sản xuất SEC1 tái tổ hợp trong E. coli, dòng tế bào chuyển gen đƣợc nuôi

cấy trong mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung thêm 100 mg/l ampicillin. Canh trƣờng đƣợc nuôi ở 30oC hoặc 37oC trong điều kiện lắc 150 vòng/phút cho đến khi OD600 nm đạt Để thu hồi sinh khối, 10 ml canh trƣờng đƣợc ly tâm ở 10000 g trong 5 phút. Sau khi loại bỏ dịch nổi, thu lấy cặn tế bào. Hòa cặn tế bào đã thu vào 1 ml dung dịch PBS 1X và tiến hành siêu âm trong đá lạnh bằng máy đồng hóa VCX130 trong 1 phút với chế độ siêu âm 10 giây, nghỉ 30 giây, công suất tối đa 130W. Ly tâm 10.000 g trong 10 phút, thu dịch nổi.

2.3.1.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEC1

Protein SEC1 tái tổ hợp ở da ̣ng dung hợp với đuôi 6 His-GST (6 Histidin- glutathione-S-transferase) ở đầu N đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực với Kit His Mag SepharoTMNi (GE Healthcare). Quy trình đƣợc tiến hành theo chuẩn của nhà sản xuất, bao gồm các bƣớc: Chuẩn bị hạt từ bằng cách hút 200 µl bi từ vào ống 1,5ml eppendorf, đặt ống eppendorf vào trong khay từ tính, loại bỏ đệm chứa. Thêm 0,5ml đệm cân bằng (sodium phosphate pH 7,4 : 500mM NaCl, 20-60 mM immidazole) vào ống, đảo ngƣợc vài lần để trộn bi từ, loại bỏ dịch nổi, lặp lại bƣớc này 2 lần (bƣớc cân bằng). Bổ sung immidazole vào 1ml mẫu (dịch nổi phá tế bào có chứa protein SEC1 tái tổ hợp) với các nồng độ khảo sát là 20 mM; 30 mM ; 40 mM; 50

mM và 60 mM immidazole. Sau đó mẫu đƣợc chuyển vào ống eppendorf chứa bi từ, đảo trộn mẫu chứa bi từ bằng máy lắc đảo ngƣợc trong 30 phút ở 4oC (bƣớc ứng dụng mẫu). Loại bỏ dịch lỏng và rửa ba lần bằng đệm liên kết, mỗi lần sử dụng 0,5ml đệm thực hiện tƣơng tự nhƣ ở bƣớc cân bằng (bƣớc rửa). Cuối cùng, protein tái tổ hợp SEC1 đƣợc đẩy ra khỏi cột bằng cách thêm 100 µl đệm rửa giải (elution buffer: 20mM sodium phosphate pH 7,4; 500 mM NaCl; 500 mM immidazole) vào ống, trộn 5 phút, sử dụng khay từ để thu thập bi từ và chuyển dịch nổi chứa protein rửa giải vào ống sạch (bƣớc rửa giải). Lặp lại bƣớc rửa giải.

2.3.1.8. Phương pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE){tc "II.2.6. Phương pháp đi?n di bi?n tính protein (SDS-PAGE)" \f C \l 3} pháp đi?n di bi?n tính protein (SDS-PAGE)" \f C \l 3}

Trong nghiên cứu này, protein SEC1 tái tổ hợp, các kháng thể IgY đƣợc xác định khối lƣợng và độ tinh sạch bằng kiểm tra điện di biến tính protein SDS-PAGE (12,5%), tiến hành theo các phƣơng pháp của Laemmli (1970). Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau: Đổ gel tách (running gel) 12,5%, gel cô (stacking gel) 4%. Pha mẫu protein với đệm mẫu (0,1 M Tris pH 6,8; 0,2 M DTT; 4% SDS; 20% glycerol; 0,2% xanh bromophenol) tỷ lệ tƣơng ứng là 3:1, đun sôi trong 10 phút, để mẫu vào đá bào. Điện di 15 µl dịch protein đã xử lý trong đệm mẫu. Bản gel đƣợc chạy trên máy điện di protein kiểu đứng của hãng BIORAD, cƣờng độ dịng điện 15mA/1 bản gel với gel cơ và 25mA/1 bản gel với gel tách, khi chỉ thị xanh bromophenol tới gần đáy bản gel thì dừng lại. Nhuộm gel qua đêm với dung dịch coomassie brilliant blue, tẩy màu bằng dung dịch rửa (methanol: axit acetic: H2O = 4 : 1 : 5) đến khi nền bản gel sáng lên. Căn cứ vào sự xuất hiện của các băng trên gel điện di có thể xác định bằng mắt thƣờng đƣợc độ tinh sạch và khối lƣợng phân tử của protein tái tổ hợp hoặc của kháng thể IgY

2.3.1.9. Phương pháp định lượng protein bằng đo mật độ quang

Nguyên tắc của phƣơng pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bƣớc sóng 280 nm do có chứa các axit amin thơm nhƣ tryptophan, tyrosine và phenylalanine. Độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm thay đổi tuỳ loại protein nhƣng hệ số tắt đo đƣợc (nghĩa là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đƣờng sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein cho phép tính đƣợc nồng độ của protein tinh sạch.

Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loại protein nào mà khơng biết hệ số tắt thì nồng độ protein đƣợc tính nhƣ sau:

Nồng độ protein (mg/ml) = 1,55 x A280 - 0,77 x A260

Trong đó: A280: độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm; A260: độ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm.

2.3.1.10. Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot Western blot

Độc tố ruột tụ cầu SEC1 (Toxin Technology) đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng và

protein SEC1 tái tổ hợp đã tinh sạch đƣợc điện di trên gel SDS-PAGE 12,5%. Các protein đƣợc chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí nhƣ đã phân tách trên gel bằng máy điện di đứng ở hiệu điện thế 100V trong 1 giờ. Phong bế (bloking) màng lai trong đệm PBS 1X có 5% sữa tách bơ (skim milk). Ủ màng lai đã cố định protein với kháng thể thỏ đặc hiệu kháng SEC (kháng thể thứ nhất -primary antibody) trong skim milk 5% ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Rửa màng lai 3 lần x 5 phút trong dung dịch PBS 1X có 0,05% Tween-20. Ủ màng lai với kháng thể dê kháng IgG thỏ (kháng thể thứ hai- secondary antibody) gắn HRP (Horse-radish peroxidase) trong skim milk 5% ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Rửa màng lai 3 lần x 5 phút trong dung dịch PBS 1X có 0,05% Tween 20. Cuối cùng, màng đƣợc hiện màu trong dung dịch chất hiện màu (5ml methanol + 15 mg 4 - chloronapthol pha trong 50 ml TBS + 30µl H2O2) trong thời gian 10

phút, đọc kết quả.

2.3.2. Phƣơng pháp sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố SE (A+B+C1+D+E) độc tố SE (A+B+C1+D+E)

Các bƣớc trong quy trình sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố SE (A+B+C1+D+E) đƣợc tóm tắt trong sơ đồ ở Hình 2.3 dƣới đây:

Hình 2.3: Sơ đồ các bước tạo kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng SE (A+B+C1+D+E)

2.3.2.1. Gây miễn dịch

Gà đƣợc gây miễn dịch để sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng BSA và kháng thể đa dòng IgY kháng các đ ộc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) theo quy trình sản xuất kháng thể IgY của Agro-Bio 2011 [11].

* Chuẩn bị gà để làm thực nghiệm

Gà mái thuộc giống gà Leghorn trắng, 1 ngày tuổi gồm 30 con, cân nặng 35- 40g/con, mua từ Cơng ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì, đƣợc ni tại Hải Dƣơng trong cùng điều kiện đầy đủ thức ăn, nƣớc uống, thời gian chiếu sáng 12/24 giờ bằng ánh sáng tự nhiên. Hàng ngày chuồng nuôi gà đƣợc vệ sinh, gà đƣợc ăn uống và theo dõi tình trạng sức khỏe. Trong q trình ni, gà khơng ốm và không dùng kháng sinh. Khi gà bắt đầu đẻ trứng ở tuần 18, chọn ra những con gà có các đặc điểm tốt cho việc đẻ trứng (vóc dáng cân đối, khơng dị tật ở mỏ, ngón chân, mồng, tích phát triển lớn, màu đỏ tƣơi, lơng óng mƣợt, cánh ép sát vào thân) để theo dõi tình trạng đẻ trứng. Sau đó, lựa chọn 6 con gà này đẻ trứng đều trong hai tuần đầu, trọng lƣợng trứng khoảng 50-60g, vỏ trứng có màu trắng, phớt hồng sử dụng cho việc gây miễn dịch, sản xuất kháng thể IgY.

- Lô 1 (2 con): gây miễn dịch với hỗn hợp kháng nguyên SEA, SEB, SEC1, SED và SEE để tạo kháng thể đa dòng IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E).

- Lô 2 (2 con): gây miễn dịch với protein BSA (Sigma) để tạo kháng thể đa dòng IgY kháng BSA.

- Lơ 3 (2 con): là nhóm đối chứng, đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý 0,9%.

* Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên gây miễn dịch cho gà

- Để gây miễn dịch cho mỗi con gà với BSA, thành phần hỗn hợp kháng nguyên BSA đƣợc chuẩn bị nhƣ sau:

Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên BSA

Ống Kháng nguyên BSA (ml) Tá dƣợc FCA (ml) Tá dƣợc FIA (ml) Nồng độ (mg/ml) 1 1 1 0 1 2 1 0 1 1 3 1 0 1 1

Dung dịch BSA nồng độ 2mg/ml trộn với tá dƣợc Freund hoàn toàn (FCA) theo tỷ lệ 1:1 ở lần tiêm đầu tiên. Dung dịch BSA nồng độ 2mg/ml đƣợc trộn với tá dƣợc Freund khơng hồn tồn (FIA) với tỷ lệ 1:1 ở 2 lần tiêm nhắc lại.

- Để gây miễn dịch cho mỗi con gà với kháng nguyên là các độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED, SEE, kháng nguyên đƣợc chuẩn bị với thành phần nhƣ sau:

Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên các SE Ống Kháng nguyên Ống Kháng nguyên SE (A-E) (µl) Nƣớc muối sinh lý(µl) Tá dƣợc FCA (µl) Tá dƣợc FIA (µl) Nồng độ (ng/ml) 1 100 400 500 0 100 2 100 400 0 500 100

- Các độc tố ruột của tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE chuẩn đƣợc mua từ