CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP THU MẪU
2.2.1. Thu mẫu rong
Rong đỏ B. gelatinus thu ở tỉnh Ninh Thuận từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2021. Khu vực thu mẫu xung quanh vị trí tọa độ 11°40'27,28"B 109°10'46,54"Đ (Hình 2.2). Thu mẫu rong ở mỗi giữa tháng, trong khoảng thời gian 9 – 10 giờ sáng, độ sâu tại thời điểm thu rong khoảng 3 – 4 m tại mức thủy triều 1,2 – 1,6 m. Mỗi lần thu 3 mẫu rong (khoảng 200 g/mẫu) ở 3 vị trí khác nhau của khu vực thu mẫu. Tiến hành lặn thu mẫu, tại mỗi vị trí của khu vực thu mẫu, dùng dao cắt từ 1 – 3 cụm rong gần sát nhau với tổng khối lượng khoảng 200 g, đánh dấu lại vị trí đã thu. Tiếp tục thu các cụm rong liền kề tại 3 vị trí đã đánh dấu trong những lần thu mẫu vào các tháng tiếp theo.
Sau khi thu, rong được rửa sạch bằng nước biển, giữ trong túi zip trong thùng xốp với đá khơ và chuyển về phịng thí nghiệm. Mẫu rong được phân loại bằng phương pháp phân loại hình thái bởi ThS. Trần Văn Huynh – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, từ các tài liệu mô tả phân loại rong đỏ B. gelatinus [73, 74].
Hình 2.2. Bản đồ khu vị trí thu mẫu rong (tỉ lệ 1: 25.000)
2.2.2. Thu mẫu nước
Hình 2.3. Sơ đồ thu và phân tích mẫu nước Mẫu nước Mẫu nước
Vì điều kiện thu mẫu khó khăn, mẫu nước được thu hàng tháng từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2021 tại cùng vị trí và cùng thời điểm thu mẫu rong ở Ninh Thuận. Mỗi lần thu 3 mẫu nước ở tầng đáy, tầng giữa và tầng trên để lấy giá trị trung bình, đựng mẫu trong chai nhựa PE (đã xử lý). Nhiệt độ nước biển được đo tại vị trí thu mẫu bằng nhiệt kế thủy ngân. Sau khi thu, các mẫu nước được giữ lạnh trong thùng xốp với đá khô và chuyển về phịng thí nghiệm và giữ lạnh ở -20 oC cho đến khi phân tích các yếu tố mơi trường. Độ pH của nước biển được đo bằng máy đo pH 827pH Lab của Metrohm - Thụy Sỹ. Độ mặn được đo bằng khúc xạ kế cầm tay S/Mill của Atago - Nhật Bản. 2.3. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT
2.3.1. Phương pháp chiết carrageenan tự nhiên
Chiết carrageenan tự nhiên theo phương pháp của Hellebust và Craige (1978) [14].
2 g bột rong khô được chiết với 200 mL 0,5 M NaHCO3 ở 90 °C trong 2 giờ với sự khuấy trộn thường xuyên. Hỗn hợp được lọc thô qua túi vải và lọc tinh bằng lọc hút chân không với chất trợ lọc diatomite. Dịch lọc được kết tủa với 50 mL dung dịch 2 % cetyltrimethylammonium bromide (Cetavlon) qua đêm. Ly tâm thu tủa, rửa tủa 3 lần với dung dịch CH3COONa bão hòa để loại bỏ Cetavlon, tiếp tục rửa tủa 3 lần trong ethanol 95 % để loại bỏ CH3COONa. Thu hồi carrageenan trong đĩa pertri và làm khô ở 60 °C trong 24 giờ. Thu mẫu và giữ ở -20 oC cho đến khi dùng.
Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết carrageenan tự nhiên được trình bày trong Hình 2.4.
Sấy 60oC, 24 giờ
Rửa 3 lần với ethanol 95 %
Rửa 3 lần với CH3COONa bão hịa trong ethanol
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình chiết carrageenan tự nhiên 2 g bột rong khô 2 g bột rong khô
Chiết carrageenan
200 mL NaHCO3 0,5M
90oC trong 2 giờ
Lọc thô qua túi vải thu dịch
Lọc tinh qua hút chân không
Kết tủa dịch lọc
Cevtavlon 2 %, 12 giờ
Ly tâm thu tủa
Ly tâm thu tủa
Ly tâm thu tủa
Carrageenan 6000 vòng/phút trong 15 phút Xác định hàm lượng carbohydrate Xác định hàm lượng 3,6- anhydro-galactose Xác định hàm lượng sulfate Xác định hàm lượng carrageenan Xác định các nhóm chức bằng phổ hồng ngoại Bột trợ lọc diatomite
2.3.2. Phương pháp chiết lectin
Chiết lectin theo phương pháp của Lê Đình Hùng và cộng sự [53]. Rong tươi thu hàng tháng được nghiền thành bột và chiết với ethanol lạnh 20 %, giữ mẫu ở 4 oC trong 18 giờ. Hỗn hợp được ly tâm ở 6.000 vòng/phút trong 30 phút. Thu dịch trong và giữ ở -20 oC cho đến khi dùng để kiểm tra hàm lượng lectin và hoạt tính ngưng kết hồng cầu.
6000 vòng/phút trong 30 phút
5 g Rong tươi
Nghiền, chiết trong ethanol lạnh 20 % Giữ ở 4 oC trong 18 giờ Ly tâm thu dịch Dịch chiết protein Xác định hàm Xác định hoạt tính
2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ CHẤT LƯỢNG CARRAGEENAN CHẤT LƯỢNG CARRAGEENAN
2.4.1. Xác định tỉ lệ rong tươi/bột rong khơ
Hình 2.6. Sơ đồ xác định tỉ lệ rong tươi/bột rong khô và chuẩn bị mẫu rong chiết carrageenan
Rong tươi sau khi thu về được xử lý theo phương pháp của Hellebust và Craige (1978) [14], cân 100 g mẫu rong tươi nghiền với ethanol 80 %, lọc sơ và phơi khô để được bột rong khô, xác định khối lượng bột rong khô. Thực hiện với từng mẫu rong ở 3 vị trí thu mẫu để lấy số liệu, sau đó trộn đều bột
100 g Rong tươi Bột rong khô Ethanol 80 % Lưu trữ ở -20oC Xác định tỉ lệ tươi/bột rong khô Nghiền trong ethanol 80 %
rong khô của các mẫu và lưu giữ ở -20 oC. Xác định tỉ lệ rong tươi/bột rong khô bằng công thức:
Tỉ lệ rong tươi/bột rong khô = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑡ươ𝑖
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑏ộ𝑡 𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑘ℎô
2.4.2. Xác định hàm lượng carrageenan
Hàm lượng carrageenan chiết tự nhiên được tính theo công thức của Hellebust và Craige [14]:
Hàm lượng carrageenan (% bột rong khô) = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑟𝑟𝑎𝑔𝑒𝑒𝑛𝑎𝑛
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 x 100
2.4.3. Xác định hàm lượng carbohydrate trong carrageenan
Hàm lượng carbohydrate được xác định theo phương pháp Dubois (1956) [17], dùng D-galactose làm chuẩn.
Lấy 0,5 mL dung dịch chuẩn ở các nồng độ galactose từ 20 đến 100 μg/mL, dung dịch mẫu (khoảng 100 - 120 μg/mL) cho vào mỗi ống nghiệm. Thêm vào mỗi ống nghiệm 0,5 mL dung dịch phenol 5 %, lắc đều các ống nghiệm và giữ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm vào mỗi ống 2,5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm và giữ các ống nghiệm trong chậu nước lạnh trong 20 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm. Mỗi mẫu được đo 3 lần và tính giá trị trung bình.
2.4.4. Xác định hàm lượng 3,6-anhydrogalactose trong carrageenan
Xác định hàm lượng 3,6-anhydrogalactose trong carrageenan theo phương pháp của Yaphe, Arsenault (1965) [18], dùng D-fructose làm chuẩn.
* Chuẩn bị dung dịch gốc:
a) Resorcinol: cân 150 mg (1,36 mmol) hòa tan trong 100 mL nước cất. Bảo quản trong chai màu, giữ trong tủ lạnh.
b) 1,1-Diethoxyethane hoặc acetal: Lấy 100μL (695 μmol) hòa tan trong 10 mL nước cất. Giữ trong chai màu, bảo quản trong tủ lạnh. Lấy 1 mL pha loãng với nước cất thành 25 mL trước khi trộn với thuốc thử.
c) Chuẩn D-fructose: cân 27 mg (150 μmol) hòa tan trong 50 mL của nước cất đã cho bảo hòa acid benzoic. Bảo quản trong tủ lạnh.
* Chuẩn bị dung dịch làm việc:
a) Thuốc thử resorcinol-acetal: thêm 100 mL HCl đậm đặc vào 9 mL dung dịch gốc resorcinol và thêm 1 mL của dung dịch gốc acetal đã được pha loãng, trộn đều. Chuẩn bị dung dịch này trước khi phân tích.
b) Chuẩn fructose: hịa tan 3 mL dung dịch gốc thành 100 mL trong nước cất. Chuẩn bị trước khi phân tích.
c) Chuẩn bị mẫu: cân 10 mg carrageenan hòa tan trong 100 mL nước cất nóng.
* Tiến hành phân tích:
Lấy 0,5 mL dung dịch chuẩn, nước cất và dung dịch mẫu (khoảng 100- 120 μg/mL) cho vào ống nghiệm. Làm lạnh các ống nghiệm trong đá, sau đó thêm 2,5 mL thuốc thử resorcinol-acetal lạnh vào mỗi ống nghiệm. Trộn đều các ống nghiệm và làm lạnh các ống nghiệm lên 20 oC trong 4 phút, sau đó đun ở 80 oC trong 10 phút. Làm lạnh ống nghiệm trong chậu đá trong 1,5 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 555 nm trong 15 phút.
Số lượng của 3,6-anhydrogalactose được xác định với chuẩn D- fructose và nhân với giá trị 1,087 theo hệ số giữa 3,6-anhydrogalactose/D- fructose. Mẫu được phân tích 3 lần để tính giá trị trung bình.
2.4.5. Xác định hàm lượng sulfate trong carrageenan
Xác định hàm lượng sulfate trong carrageenan theo phương pháp của Terho, Hartiala (1971) [19], dùng Na2SO4 làm chuẩn.
Thuốc thử:
* Dung dịch đệm BaCl2:
CH3COOH 2 M: 10 mL BaCl2 0,005 M: 2 mL
NaHCO3 0,02 M: 8 mL Ethanol 96%: 80 mL
* Dung dịch rhodizonate sodium: hòa tan 5 mg rhodizonate sodium trong 20 mL nước cất, thêm vào dung dịch 100 mg acid ascorbic và trộn đều cho đến khi tan hoàn toàn. Thêm ethanol 96% vào hỗn hợp đến 100 mL. Dung dịch có màu nâu nhạt và có thể dùng sau 30 phút.
* Dung dịch sulfate chuẩn: 2 – 12 µg sulfate (Na2SO4 hoặc H2SO4)/0,5 mL.
* Tiến hành phân tích: lấy 0,5 mL mẫu chuẩn, mẫu polysaccharide (100 – 120 µg/mL) và nước cất cho vào các ống nghiệm, thêm 2 mL ethanol 96 % vào các ống nghiệm, trộn đều. Sau đó, thêm 1,0 mL dung dịch đệm BaCl2 và 1,5 mL dung dịch rhodizonate sodium, trộn đều. Giữ các ống nghiệm trong tối ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm trong 30 phút. Mẫu được phân tích 3 lần để tính giá trị trung bình.
2.4.6. Xác định các nhóm chức của carrageenan bằng phổ hồng ngoại ngoại
Màng được chuẩn bị bằng cách làm khô 5 mL (5 mg/mL) dung dịch mẫu trên bề mặt polyethylen ở 60 oC, trộn với KBr, ép thành viên đồng nhất và đưa vào ngăn chứa mẫu của máy đo phổ. Các dải quang phổ được ghi lại trong khoảng từ 4000 đến 500 cm-1 trên máy quang phổ ALPHA chế độ Bruker, Đức.
Phổ Fourier-Transform Infrared (FT-IR) của mẫu carrageenan được đo trên máy Bruker mode ALPHA ở Viện Cơng nghệ Hóa học Tp. Hồ Chí Minh.
2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT LECTIN HOẠT TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT LECTIN
2.5.1. Xác định hàm lượng protein
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự [83], dùng albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn.
* Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.
- Đo cường độ màu ở bước sóng 750nm.
- Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein ở nồng độ vài chục µg.
* Hóa chất
- Dung dịch A: 4 g NaOH (0,1 M) và 20 g Na2CO3 2 % pha trong 1000 mL nước cất.
- Dung dịch B: 0,5 g CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch Sodium citrate (1 %) hoặc trong dung dịch Sodium – Potassium tartrate 1 %.
- Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (v/v), pha trước khi sử dụng.
- Thuốc thử Folin: pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng. - Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/mL.
* Các bước tiến hành
- Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10 mL nước cất, thu được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/mL.
- Sau đó, pha lỗng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/mL để tiến hành xây dựng đường chuẩn.
- Lấy chính xác 0,5 mL dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút.
- Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 mL thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút.
- Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu ở bước sóng 750nm.
Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường.
Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị tương tự như đã nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính hàm lượng protein trong các mẫu.
2.5.2. Xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu
Chuẩn bị huyền phù hồng cầu thỏ 2 %. Máu được rửa từ 3 đến 5 lần với 50 lần thể tích dung dịch NaCl 0,15 M. Sau khi rửa, cho dung dịch enzyme trypsin 0,5 % (w/v) vào huyền phù hồng cầu, trộn đều và ủ ở 37 oC trong 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu các mẫu máu được rửa từ 3 đến 5 lần với dung dịch muối và hòa lại bằng dung dịch đệm phosphate 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2. Ta thu được huyền phù hồng cầu các mẫu máu 2 % đã xử lý enzyme trypsin [37].
Hoạt tính của lectin được xác định dựa trên phương pháp ngưng kết hồng cầu [37]. Các thí nghiệm phân tích hoạt tính của lectin được thực hiện trong đĩa 96 giếng đáy chữ V. Đầu tiên, cho 25 µL dung dịch đệm phosphate 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V. Tiếp đến cho 25 µL mẫu dịch chiết lectin cần phân tích hoạt tính ngưng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo và giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 1 giờ. Sau đó, tiếp tục thêm 25 µL hồng cầu 2 % vào tất cả các giếng, lắc nhẹ hỗn hợp và giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.
Kết quả dương tính được thể hiện khi hình thành một lớp chất keo đồng nhất trên bề mặt giếng. Kết quả thử nghiệm là âm tính khi tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ. Hoạt tính của lectin (HU/mL) được thể hiện như là một tiêu chuẩn, và là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch chiết lectin cịn có khả năng làm ngưng kết hồng cầu cho vào phản ứng.
2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG
Xác định hàm lượng nitơ tổng, phosphate theo phương pháp của Parsons và cộng sự (1984) [84].
2.6.1 Phương pháp xác định nitơ tổng
- Phân tích Amoni
Cho vào bình nón 50 mL dung dịch mẫu, thêm 2 mL phenol, thêm 2 mL sodium nitroprusside và 5 mL thuốc thử, lắc đều sau mỗi lần thêm dung dịch. Để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Đem so màu với mẫu trắng ở bước sóng 640 nm.
- Phân tích Nitrite
Nitrite trong nước biển phản ứng với sulfanilamide và N-(1-naphthyl)- ethylenediamine tạo màu hồng đỏ.
Lấy 50 mL mẫu, thêm 1 mL dung dịch sulfanilamide, để hỗn hợp phản ứng trong 2-10 phút. Thêm 1 mL thuốc thử N-(1-naphthyl)-ethylenediamine. Đem so màu với mẫu trắng ở bước sóng 543 nm.
- Phân tích Nitrate
Chuyển đổi nitrate trong mẫu nước thành nitrite bằng cột cadmium, phân tích theo phương pháp phân tích nitrite.
Lấy 100 mL mẫu nước biển, thêm 2 mL NH4Cl đậm đặc, lắc đều, đổ khoảng 5 mL vào cột cho chạy hết và đổ bỏ. Thu khoảng 50 mL dung dịch qua cột cadmium, thêm 1 mL dung dịch sulfanilamide, để hỗn hợp phản ứng
trong 2-10 phút. Thêm 1 mL thuốc thử N-(1-naphthyl)-ethylenediamine. Đem so màu với mẫu trắng ở bước sóng 543 nm.
Hàm lượng nitơ tổng bằng tổng hàm lượng của amoni, nitrite, nitrate.
2.6.2. Phương pháp xác định phosphate
Phản ứng giữa orthophosphate với ammonium molybdate với xúc tác potassium antimonyl-tartrate trong môi trường acid tạo ra phức chất phosphomolybdate. Khử phức chất bằng acid ascorbic tạo thành phức chất molybden màu xanh đậm. Đo độ hấp thụ của phức chất để xác định nồng độ orthophosphate.
Lấy 50 mL dung dịch mẫu, thêm vào mỗi bình 5 mL dung dịch thuốc thử là hỗn hợp của ammonium molybdate, potassium antimonyl-tartrate, acid ascorbic, H2SO4. Đo độ hấp thụ của mỗi dung dịch bằng máy đo phổ sau 30 phút ở bước sóng 880 nm.
2.6.3. Phương pháp xác định độ mặn và pH của nước biển
- Nhiệt độ được đo tại vị trí và thời điểm thu mẫu bằng nhiệt kế thủy ngân. Đo kết quả ở tầng đáy, tầng giữa và tầng mặt để lấy giá trị trung bình.
- Độ pH của nước biển được đo bằng máy đo pH 827pH Lab của Metrohm - Thụy Sỹ.
- Độ mặn được đo bằng khúc xạ kế cầm tay S/Mill của Atago - Nhật Bản.
2.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ VÀ ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN QUAN
- Phân tích thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Excel để xác định