CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT
HOẠT TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT LECTIN
2.5.1. Xác định hàm lượng protein
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự [83], dùng albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn.
* Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.
- Đo cường độ màu ở bước sóng 750nm.
- Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein ở nồng độ vài chục µg.
* Hóa chất
- Dung dịch A: 4 g NaOH (0,1 M) và 20 g Na2CO3 2 % pha trong 1000 mL nước cất.
- Dung dịch B: 0,5 g CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch Sodium citrate (1 %) hoặc trong dung dịch Sodium – Potassium tartrate 1 %.
- Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (v/v), pha trước khi sử dụng.
- Thuốc thử Folin: pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng. - Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/mL.
* Các bước tiến hành
- Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10 mL nước cất, thu được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/mL.
- Sau đó, pha lỗng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/mL để tiến hành xây dựng đường chuẩn.
- Lấy chính xác 0,5 mL dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút.
- Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 mL thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút.
- Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu ở bước sóng 750nm.
Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thơng thường.
Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị tương tự như đã nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính hàm lượng protein trong các mẫu.
2.5.2. Xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu
Chuẩn bị huyền phù hồng cầu thỏ 2 %. Máu được rửa từ 3 đến 5 lần với 50 lần thể tích dung dịch NaCl 0,15 M. Sau khi rửa, cho dung dịch enzyme trypsin 0,5 % (w/v) vào huyền phù hồng cầu, trộn đều và ủ ở 37 oC trong 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu các mẫu máu được rửa từ 3 đến 5 lần với dung dịch muối và hòa lại bằng dung dịch đệm phosphate 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2. Ta thu được huyền phù hồng cầu các mẫu máu 2 % đã xử lý enzyme trypsin [37].
Hoạt tính của lectin được xác định dựa trên phương pháp ngưng kết hồng cầu [37]. Các thí nghiệm phân tích hoạt tính của lectin được thực hiện trong đĩa 96 giếng đáy chữ V. Đầu tiên, cho 25 µL dung dịch đệm phosphate 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V. Tiếp đến cho 25 µL mẫu dịch chiết lectin cần phân tích hoạt tính ngưng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo và giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 1 giờ. Sau đó, tiếp tục thêm 25 µL hồng cầu 2 % vào tất cả các giếng, lắc nhẹ hỗn hợp và giữ ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ.
Kết quả dương tính được thể hiện khi hình thành một lớp chất keo đồng nhất trên bề mặt giếng. Kết quả thử nghiệm là âm tính khi tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ. Hoạt tính của lectin (HU/mL) được thể hiện như là một tiêu chuẩn, và là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch chiết lectin cịn có khả năng làm ngưng kết hồng cầu cho vào phản ứng.