trường nuôi cấy
Sốlượng tế bào
đầu vào/10 lít
môi trường
Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi 7,0±0,1
1,5 x109 3 lần
Xác định tỷ lệ tế bào bám hạt
sau 24 giờ nuôi cấy, năng suất sinh sản của tế bào sau 72 giờ
7,2±0,1
7,4±0,1
3.5.1.4. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của tế bào PK 15
Để xác định thời gian nuôi cấy thích hợp tế bào PK 15 trên Microcarrier, chúng tôi tiến hành xác định đường cong sinh trưởng của tế bào PK 15 khi nuôi trên hệ thống Microcarrier quy mô 10 lít với các điều kiện đã được tối ưu ở các công việc trước đó: số tếbào đầu vào: 1,5 x 109 tế bào; pH = 7,0±0,1; môi trường nuôi MEM 5% FBS+KS; tốc độ khuấy = 50, DO= 50%, Lưu lượng khí =0,6 l/phút. Trên hệ thống nuôi cấy với thể tích 10 lít, sau 24, 48, 72, 96, 120, 144h nuôi cấy chúng tôi tiến hành lấy mẫu tách và đếm số lượng tế bào, lặp lại thí nghiệm 03 lần để xây dựng đường cong sinh trưởng trung bình của tế bào PK 15. Từđường cong sinh trưởng của tế bào PK 15 xác định được thời gian nuôi cấy tế bào thích hợp trước khi gây nhiễm vi rút DTL.
Các bước thực hiện trong nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier với thểtích 10 lít như sau:
*)Khôi phục tế bào:
chóng trong bểổn nhiệt 370C. Sau rã đông chuyển ống vào Laminar air flow (Laf) vô trùng, chuyển hỗn dịch tế bào vào ống ly tâm có chứa môi trường nuôi cấy đã được làm ấm của tế bào tương ứng. Ly tâm hỗn dịch tế bào trong khoảng 1500v/10 phút.
Sau ly tâm loại bỏ phần dịch nổi, giữ phần tế bào lắng cặn ở dưới. Hoàn nguyên bằng môi trường nuôi tế bào. Trộn đều bằng cách dùng pipet hút nhả.
Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào Tfask có môi trường nuôi dưỡng bổ sung huyết thanh và kháng sinh.
Ủ chai nuôi cấy ở tủấm 370C, 5% CO2.
Qua 1 ngày, loại bỏmôi trường nuôi dưỡng cũ để loại bỏ DMSO, rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS rồi cho môi trường nuôi dưỡng mới bổ sung huyết thanh. Ủ chai nuôi tế bào ở tủấm 370C, 5% CO2 để tế bào phát triển.
Hằng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi quang học.
*) Tách tế bào
Rửa chai tế bào bằng PBS(-): 1 – 2 lần. Cho TE 0,05%, láng chai Ủ 370C, 5 – 15 phút, cho tới khi tế bào co tròn, bắt đầu bong khỏi đáy chai, vỗ nhẹ chai nuôi, trung hòa bằng môi trường 5% huyết thanh. Đếm số tế bào trên buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào. Tính toán và chia tế bào ra các chai nuôi ở tủấm 370C.
Hàng ngày quan sát khảnăng phát triển của tế trong các chai tế bào trên kính hiển vi quang học.
Nhân sốlượng tế bào trên các chai nuôi cấy.
Để đủ số lượng tế bào PK 15 nuôi trên hệ thống Microcarrier với dung tích 10 lít, 30g hạt Cytodex-1, tế bào PK 15 cần phải được nhân theo từng cấp độ với quy mô lớn dần. Quy trình nhân sốlượng tếbào được mô tảtrong hình dưới đây:
*) Phương pháp đếm tế bào
Chuẩn bị buồng đếm
Dùng vải gạc sạch, tẩm cồn lau sạch buồng đếm và phiến kính đậy. Để buồng đếm và phiến kính đậy khô hoàn toàn (có thểhơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn).
Đặt buồng đếm trên mặt phẳng ngang rồi đặt phiến kính đậy vào vị trí buồng đếm. Chú ý không để phiến kính đậy bị lệch, kênh.
Hình 3.3. Buồng đếm tế bào
Trên buồng đếm tếbào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới. Mỗi vùng có 4 ô đếm.
Khi đếm, kết quảđếm được tính trên cả2 vùng đếm bao gồm 8 ô đếm.
1m 1m 1m
1
mm
Vùng đếm Ô đếm
Trong mỗi ô đếm, thứ tựđếm được mô tảnhư trên hình vẽ.
Tiến hành đếm số lượng tế bào sau đó tiến hành tính toán theo công thức
Công thức:
C Hệ số pha loãng tế bào A Số tếbào đếm lần 1 B Số tếbào đếm lần 2
16 Sốô đếm của 2 buồng (8 ô × 2 buồng đếm)
104 Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
V Thể tích bình nuôi cấy tế bào
3.5.2. Phương pháp gây nhiễm
3.5.2.1. Phương pháp xác định môi trường duy trì và pH của môi trường duy trì
Môi trường cho nuôi cấy vi rút DTL là thành phần quan trọng ảnh hưởng đến hiệu giá của vi rút thu được. Đểxác định được loại môi trường thích hợp cho nuôi vi rút DTL trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi tham khảo môi trường nuôi cấy DTL trên chai phẳng và tiến hành nuôi cấy vi rút DTL thử nghiệm trên hệ thống Microcarrier với các loại môi trường khác nhau:
Lactanbumin Hydrolysate (LH),Medium 199 (M199),Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Bốn loại môi trường trên được pha bổ sung thêm một số thành phần như (Thể tích/ Thể tích): 1% huyết thanh bào thai bê (FBS) +0,1% kháng sinh + 1% Hepes 1M, pH= 7,0±0,1.
Cài đặt thông số cho hệ thống như sau: tốc độ khuấy 60 vòng/phút; lưu lượng khí 0,6 lít/phút; DO=50%.Thí nghiệm được bố trí trong bảng 3.7
Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi Môi trường nuôi
cấy Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi LH
10 lít 3 lần
Hiệu giá vi rút Dịch tả
lợn nhân lên sau 72 giờ
gây nhiễm.
M199 MEM DMEM
Khi có kết quảxác định được loại môi trường duy trì chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định pH môi trường nuôi cấy như dưới bảng:
Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy pH của môi pH của môi
trường nuôi cấy Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi 7,0±0,1
10 lít 3 lần
Hiệu giá vi rút Dịch tả
lợn nhân lên sau 72 giờ gây nhiễm.
7,2±0,1
7,4±0,1
3.5.2.2. Phương pháp xác định liều nhiễm của vi rút
Với mục đích thu được nguyên dịch vi rút DTL có hiệu giá tối ưu nhất, chúng tôi tiến hành xác định liều gây nhiễm thích hợp (multiplicity of infection – MOI). Phương pháp gây nhiễm vi rút DTL được thực hiện với 4 liều MOI khác nhau (0,01;0,005;0,001; 0,0005). Cài đặt thông số cho hệ thống như sau: tốc độ khuấy 60 vòng/phút; lưu lượng khí 0,6 lít/phút; DO=50%.
Bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm xác định liều gây nhiễm thích hợp MOI Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi