Phần 3 Nội dung vật liệu phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Phương pháp đánh giá 1 số chỉ tiêu của vắc xin DTL sau đông khô
Từ nguyên dịch thu được, chúng tôi pha chế với bổ trợ và tá dược vừa đủ theo công thức phối trộn hiện đang áp dụng cho sản xuất vắc xin và được đông khô theo quy trình của công ty Hanvet.
Vắc xin sau đông khô được gửi lên phòng QC - công ty Hanvet kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, vô trùng, thuần khiết, hiệu giá. Tất cả các chỉ tiêu của vắc xin sau đông khô đều đạt yêu cầu. Trong thời gian gửi mẫu lên QC chúng tôi đã tiến hành đánh giá tính an toàn và hiệu lực của vắc xin trên lợn.
3.5.3.1. Phương pháp kiểm tra tính an toàn của vắc xin trên lợn
Thí nghiệm được bốtrí như sau:
Bảng 3.10. Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính an toàn của vắc xin DTL trên lợn
Nhóm TN Liều tiêm Số lợn thí
nghiệm/nhóm Chỉ tiêu theo dõi 1 10 liều sử dụng 5 lợn/nhóm (20- 30kg khỏe mạnh) - Triệu chứng lâm sàng. 2 20 liều sử dụng 3 30 liều sử dụng Đối chứng Không tiêm 3 lợn
3.5.4.2. Phương pháp kiểm tra tính sinh miễn dịch của vắc xin trên lợn
a. Đáp ứng miễn dịch dịch thể
Tiến hành miễn dịch cho lợn với liều 1ml vắc xin pha loãng 100 lần (theo TCVN 8685-8:2011). Bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau:
Bảng 3.11. Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính sinh miễn dịch của vắc xin DTL Nhóm Nhóm
TN Liều tiêm Số lợn thí
nghiệm/nhóm Chỉ tiêu theo dõi
1 1/100 liều sử
dụng
05 - Lấy máu tại các thời điểm 0, 7, 14, 21, 28, 35 ngày sau khi tiêm để:
+ Xác định hiệu giá kháng thể bằng phản
ứng ELISA.
+ Xác định hiệu giá kháng thể trung hòa
Công cường độc cho lợn tại thời điểm 35
ngày sau miễn dịch với liều 102 MLD
Phản ứng trung hòa vi rút trên tế bào
Kháng thể đặc hiệu sinh ra bởi vi rút DTL có khả năng trung hòa vi rút, làm mất khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào. Vì vậy có thể sử dụng phản ứng này đểxác định hàm lượng kháng thể kháng vi rút DTL có trong huyết thanh động vật. Các bước tiến hành như sau:
Bước 1: Chuẩn bị kháng nguyên. Kháng nguyên trong phản ứng trung hòa là là vi rút DTL chuẩn đã được xác định các thông số về độ vô trùng và liều gây nhiễm. Kháng nguyên được pha loãng về hàm lượng 100 TCID50/50µl để dùng cho phản ứng.
Bước 2: Pha loãng huyết thanh. Các huyết thanh cần xác định vềhàm lượng kháng thể kháng vi rút DTL được pha loãng theo cơ số 2 (từ 2-1đến 2-x) tùy thuộc vào hàm lượng kháng thể dựđoán.
Bước 3: Trung hòa vi rút: Trộn một lượng tương đương vi rút chuẩn ở trên với huyết thanh đã pha loãng ở các nồng độ khác nhau. Hỗn dịch trung hòa này được ủở 370C trong 60 – 90 phút.
Bước 4: Gây nhiễm lên tế bào: Hỗn dịch trung hòa sau khi ủđược gây nhiễm vào các giếng tế bào PK 15 trên đĩa 96 giếng đã chuẩn bị trước, mỗi giếng tế bào nhỏ 100µl hỗn dịch trung hòa. Sau đó bổ sung thêm vào tất cả các giếng tế bào 100 µl môi trường duy trì. Ủ đĩa 96 giếng ở 370C 5%CO2 trong 72 giờ thì lấy đĩa ra làm phản ứng IFA đểxác định sự có mặt của vi rút DTL. Và ghi nhận kết quả.
Hiệu giá kháng thể trung hòa là nghịch đảo của độ pha loãng huyết thanh cao nhất mà ởđó vi rút vẫn bị trung hòa hoàn toàn.
Phản ứng ELISA
Nguyên lý của phản ứng được thực hiện dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Kít IDEXX CSFV Ab Test được sử để xác định hiệu giá kháng thể DTL sau khi tiêm trên lợn. Các bước thực hiện phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất được mô tả chi tiết như sau:
Bước 1: Bổ sung 50 µl dung dịch pha loãng vào các giếng kiểm tra và giếng đối chứng.
Bước 2: Bổ sung 50 µl mẫu đối chứng dương (Positive Control) và mẫu đối chứng âm (Negative Control) vào các giếng đối chứng. Sử dụng riêng rẽ từng đầu tip cho từng loại mẫu.
Bước 3: Bổ sung 50 µl mẫu huyết thanh kiểm tra vào từng giếng và ghi lại thứ tự mẫu. Sử dụng riêng rẽ từng đầu tip cho từng mẫu khác nhau.
Bước 4: Trộn đều các thành phần trong giếng ELISA bằng cách vỗ nhẹ vào cạnh đĩa.
Bước 5: Ủđĩa trong 2h ±5 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 6: Rửa đĩa ELISA bằng dung dịch rửa 1X (Wash solution). Rửa 200µl/giếng/1 lần tiến hành rửa 3 lần.
Bước 7: Bổ sung 100µl/giếng kháng thể cộng hợp (Anti-CSFV-HRPO Conjugate). Ủđĩa trong 30±1 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 8: Lặp lại bước 6.
Bước 9: Bổ sung 100µl/giếng cơ chất (TMB Substrate N.12). Ủ đĩa trong 10±1 phút.
Bước 10: Sau 10 phút ủ với cơ chất tiến hành dừng phản ứng bằng 100µl/giếng dung dịch Stop Solution N.3.
Bước 11: Đo độ hấp phụ quang của các giếng kiểm tra và giếng đối chứng ở bước song 450nm và tính toán theo công thức.
Chú ý:
Phản ứng ELISA đạt thành công khi giá trị OD450 đối chứng âm (NEG) ≥ 0,5 Giá trị Blocking (%) của mẫu đối chứng dương (POS) ≥ 50%.
Tính toán
Quy ước kết quả:
Mẫu được coi là dương tính khi giá trịBlocking ≥ 40%; Mẫu được coi là âm tính khi giá trịBlocking ≤ 30%;
Nếu giá trị Blocking mẫu > 30% và < 40% thì mẫu nghi ngờ. Kết quảđó nên thực hiện lại và kết quả vẫn nghi ngờ nên kiểm tra lại bằng phương pháp trung hòa để cho kết quả chính xác.