Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Nghiên cứu quy trình gây nhiễm vi rút dịch tả lợn trên Microcarrier
TRÊN MICROCARRIER
4.2.1. Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm vi rút và pH của môi trường duy trì trường duy trì
4.2.1.1. Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm vi rút
Môi trường duy trì tế bào sau nhiễm là môi trường nuôi tế bào có ít hoặc không có huyết thanh động vật. Môi trường duy trì có tác dụng duy trì sự sinh trưởng ổn định của tế bào tạo điều kiện tối ưu cho quá trình xâm nhập và nhân lên của vi rút.
Để tìm ra loại môi trường duy trì tế bào trong quá trình gây nhiễm vi rút đạt hiệu giá vi rút cao nhất khi thu hoạch. Tiến hành thử nghiệm trên 4 công thức môi trường: MEM, DMEM, M119 và LH. Tuy nhiên, sự duy trì sinh trưởng tế bào bị ảnh hưởng bởi hàm lượng huyết thanh và pH môi trường. Tất các công thức môi trường bổ sung 1% huyết thanh và pH=7,2±0,1 theo các nghiên cứu trên hệ thống chai Tflask.
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần với các điều kiện nuôi tếbào, phương pháp gây nhiễm, thông số tối ưu giống nhau.
Kết quả theo dõi khảnăng gây bệnh tích tếbào được thể hiện ở bảng 4.11.
Bảng 4.11. Kết quả xác định hiệu giá vi rút DTL trên các loại môi trường nhiễm môi trường nhiễm
Hiệu giá (TCID50/ml)
LH M199 MEM DMEM Lô 1 106,1-106,3 106,3-106,5 106,9-107,1 106,5-106,7 Lô 2 106,3-106,3 106,1-106,3 106,7-106,9 106,3-106,5 Lô 3 106,1-106,1 106,3-106,5 106,7-106,9 106,3-106,5 TB 106,2±0,11 106,33±0,13 106,87±0,13 106,47±0,13 Từ bảng 4.11 ta có đồ thị hình 4.10
Hình 4.10. Đồ thị thể hiện hiệu giá trung bình (3 lô) của 4 loại môi trường duy trì của 4 loại môi trường duy trì
Nhìn vào kết quả ta thấy: Hiệu giá trung bình vi rút dịch tả lợn khi nuôi cấy bằng cả 4 loại môi trường đều cho hiệu giá vi rút chênh lệch nhau không nhiều. Tuy nhiên, môi trường MEM cho hiệu giá trung bình cao nhất ở cả 3 lô, trung bình 3 lô đạt 106,87±0,13 TCID50/ml. Môi trường LH hiệu giá trung bình 3 lô đạt 106,2±0,11TCID50/ml, môi trường M199 trung bình đạt 106,33±0,13TCID50/ml, Môi trường DMEM trung bình đạt 106,47±0,13TCID50/ml.
Sử dụng phần mềm Minitab 16 (ANOVA), P< 0,005. Như vậy, chúng tôi lựa chọn môi trường MEM 1% FBS có bổ sung 1% kháng sinh và 1% Hepes làm nuôi cấy để tiếp tục tiến hành các thử nghiệm tiếp theo đối với vi rút dịch tả lợn.
4.2.1.2. Xác định pH môi trường duy trì sau gây nhiễm vi rút
Sau khi xác định được môi trường duy trì cho nuôi cấy vi rút DTL tôi tiến hành xác định pH tối ưu để nuôi vi rút đạt hiệu quả cao. Tôi tiến hành thí nghiệm với pH = 7,0±0,1; pH= 7,2±0,1; pH= 7,4±0,1.
Kết quảđược trình bày dưới bảng 4.12.
Bảng 4.12. Kết quả hiệu giá vi rút Dịch tả lợn ởcác điều kiện pH khác nhau Hiệu giá (TCID50/ml) Hiệu giá (TCID50/ml)
pH = 7,0±0,1 pH = 7,2±0,1 pH= 7,4±0,1
Lô 1 105,9-106,1 106,9-107,1 106,3-106,5
Lô 2 105,7-105,9 106,7-106,9 106,1-106,3
Lô 3 105,9-105,9 106,9-106,9 106,3-106,3
Ở các điều kiện pH môi trường nuôi khác nhau thu được nguyên dịch vi rút với hiệu giá vi rút khác nhau. Tuy nhiên ở cả 3 lô thí nghiệm đều cho kết quả ở điều kiện môi trường nuôi có pH = 7,2±0,1 cho hiệu giá(106.9±0,12TCID50/ml)cao hơn hẳn môi trường nuôi pH = 7,0±0,1; pH = 7,4±0,1.
Sử dụng phần mềm Minitab 16 (ANOVA), P< 0,005 nên chúng tôi lựa chọn pH= 7,2±0,1 để nuôi vi rút DTL.
4.2.2. Xác định liều gây nhiễm (MOI) cho vi rút DTL
Để xác định liều gây nhiễm vi rút thích hợp tôi tiến hành thí nghiệm với 4 liều MOI khác nhau. Kết quả theo dõi thí nghiệm được trình bày tại bảng 4.13
Bảng 4.13. Kết quả hiệu giá vi rút của các liều gây nhiễm (MOI) Thời gian
gây nhiễm vi rút
(giờ)
Hiệu giá vi rút (log10 TCID50/ml)
0,01 0,005 0,001 0,0005 48h 6,5 6,1 4,7 4,1 54h 5,9 5,7 5,5 4,8 72h 5,5 5,3 7,1 6,3 96h 4,9 5,1 6,5 6,7 Từ bảng 4.13 chúng tôi tiến hành xây dựng đồ thị hình 4.11
Ở liều gây nhiễm 0,01 sau 48 giờ gây nhiễm hiệu giá vi rút đạt cao nhất, trung bình là 106,5 TCID50/ml và sau 54 giờ gây nhiễm vi rút hiệu giá bắt đầu giảm, theo dõi đến 96 giờ sau nhiễm hiệu giá vi rút còn 104,9 TCID50/ml.
Ở liều gây nhiễm 0,005 sau 48 giờ gây nhiễm hiệu giá vi rút đạt cao nhất, trung bình là 106,1 TCID50/ml và sau 54 giờ gây nhiễm vi rút hiệu giá bắt đầu giảm, theo dõi đến 96 giờ sau nhiễm hiệu giá vi rút còn 105,1 TCID50/ml.
Ở liều gây nhiễm 0,001 hiệu giá vi rút tăng dần theo thời gian gây nhiễm, hiệu giá đạt cao nhất sau 72 giờ gây nhiễm (107,1 TCID50/ml), sau 96 giờ nuôi nhiễm hiệu giá vi rút bắt đầu giảm dần.
Ở liều nhân nhiễm 0,0005 liều nhân nhiễm thấp, mức độ thể hiện CPE thấp nên hiệu giá vi rút đạt cao nhất sau 96 giờ gây nhiễm (106,7 TCID50/ml).
Sử dụng phần mềm minitab 16 (ANOVA), P< 0,005 nên chúng tôi sử dụng liều gây nhiễm 0,001 vi rút đạt hiệu giá cao nhất tại thời điểm 72h thu hoạch.
4.2.3. Xác định đường cong sinh trưởng của vi rút DTL
Do vi rút không gây bệnh tích tế bào, chính vì vậy không thể quan sát bệnh tích bằng kính hiển vi thông thường. Do đó để xác định chính xác thời điểm thu hoạch vi rút tôi ưu, chúng tôi tiến hành lấy mẫu tại các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 80h, 96h,108h, 120h sau đó chuẩn độ hiệu giá và xác định sự có mặt của vi rút DTL bằng phản ứng IFA. Kết quả theo dõi thí nghiệm được trình bày tại bảng 4.14.
Bảng 4.14. Kết quả hiệu giá vi rút DTL qua các thời điểm thu hoạch
Thời điểm thu hoạch vi rút (giờ) 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Hiệu giá vi rút Lần 1 10 4,5 104,7 105,9 106,5 107,1 107.3 106,5 105,3 104,5 Lần 2 10 4,3 104,9 105,7 106,3 107.3 107,1 106,7 105,5 104,7 Lần 3 10 4,1 104,5 105,7 106,7 107,3 107,1 106,5 105,3 104,5 TB 104,23±0,2 104,7±0,2 105,77±0,1 106,5±0,2 107,17±0,2 107,13±0,2 106,57±0,2 105,37±0,1 104,57±0,1
Từ bảng số liệu chúng tôi xây dựng được đường cong sinh trưởng của giống vi rút DTL như hình 4.12.
Hình 4.12. Đường cong sinh trưởng của vi rút DTL
Qua bảng số liệu và đồ thị sinh trưởng, phát triển của vi rút DTL cho thấy: Sau gây nhiễm 24 giờ vi rút bắt đầu qúa trình sinh trưởng, hàm lượng vi rút phát triển tăng dần theo thời gian nhiễm và đạt cao nhất vào khoảng 72 – 84 giờ sau gây nhiễm (107.13±0,2TCID50/ml.). Sau thời điểm 96 giờ, hiệu giá vi rút giảm nhanh chóng. Đến thời điểm 120 giờ sau gây nhiễm hiệu giá vi rút chỉ còn 104,57±0,1 TCID50/ml. Từđó chúng tôi rút ra kết luận: thời điểm thu hoạch vi rút tốt nhất là 72 giờ sau gây nhiễm. Tại thời điểm này hàm lượng vi rút đạt cao nhất và hiệu giá vi rút ổn định nhất.
Sau đây là hình ảnh bệnh tích của vi rút DTL trên tế bào PK 15 khi nhuộm bằng phản ứng IFA:
Hình 4.13. Hình ảnh nhuộm IFA của vi rút DTL
Sau khi chốt các thông số cho quy trình thu hoạch vi rút trên hệ thống Microcarrier. Tôi tiến hành so sánh với hiệu giá vi rút thu được trên hệ thống Microcarrier với hệ thống T-flask đã được công ty áp dụng sản xuất trước đó. Kết quảđược thể hiện qua đồ thị sau:
Hình 4.14. So sánh hiệu suất nuôi cấy vi rút trên hệ thống Microcarrier và T- flask
Nhìn vào hình 4.14 ta nhận thấy hiệu giá vi rút DTL thu được khi sản suất trên công nghệ Microcarrier cao nhất thu được tại thời điểm 72 giờ là 107.17 TCID50/ml trong khi hiệu giá vi rút cào nhật khi nuôi cấy trên Tflask thu được tại thời điểm 96h sau gây nhiễm là 106.3 TCID50/ml. Như vậy hiệu giá vi rút Dịch tả lợn khi nuôi cấy trên Microcarrier cao hơn T-flask gấp 7,4 lần. Mặt khác, khi sử dụng công nghệ Microcarrier còn giảm thiểu nhận lực làm việc, giảm thiểu tạp trùng, hạn chế thao tác, hệ thống gọn không cồng kềnh, không tốn diện tích như T- flask. Chính vì vậy, tôi lựa chọn sản suất vi rút DTL bằng hệ thống Microcarrier.