Phần 3 Nội dung vật liệu phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
3.5.1.1. Phương pháp xác định tốc độ khuấy và lưu lượng khí
Phương pháp xác định tốc độ khuấy
Để lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp để nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi thực hiện khuấy với 3 tốc độ khuấy khác nhau 30, 60, 90rpm. Bố trí cụ thểđược trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp Tốc độ khuấy Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi Tốc độ khuấy Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi
30 Thể tích nuôi cấy 10 lít 3 lần Khảnăng lắng của hạt, khảnăng tạo bọt môi trường 60 90 Phương pháp xác định DO
Để lựa chọn giá trị DO thích hợp cho nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi thực hiện với giá trị DO khác nhau 30%, 40%, 50%, 60%. Bố trí cụ thểđược trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm xác định tốc độ khuấy thích hợp Giá trị DO Giá trị DO
(%)
Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêutheo dõi 30
Thể tích nuôi cấy
10 lít 3 lần
Xác định tỷ lệ hạt có tế bào
bám sau 24 giờ nuôi cấy,
năng suất sinh sản của tế bào
sau 48 giờ.
40
50
60
Phương pháp xác định lưu lượng khí
Theo thiết kế của hệ thống, lưu lượng khí cấp vào trong khoảng từ 0,2 - 1 lít/phút. Để xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp, chúng tôi sử dụng khí trộn của 4 loại khí N2, O2, CO2, không khí với các lưu lượng khí khác nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 lít/phút cấp vào trong môi trường trên hệ thống Microcarrier, tốc độ khuấy 60, DO =50%. Bố trí thí nghiệm được trình bày bảng dưới đây:
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm xác định lưu lượng khí trong bình nuôi Lưu lượng khí cấp Lưu lượng khí cấp
vào (lít/phút)
Thể tích môi
trường Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi 0,2
Thể tích nuôi cấy
10 lít 3 lần
Khảnăng tạo bọt trong
môi trường nuôi cấy, thời
gian ổn định giá trị DO
0,4
0,6
0,8
1,0
3.5.1.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào đầu vào
Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đối với nuôi cấy Microcarrier trong khoảng 0,5 – 2x105 tế bào/ml. Để xác định mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu tối ưu trong nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi tiến hành nuôi tế bào PK 15 trong 10 lít môi trường nuôi cấy với mật độ tế bào bổ sung ban đầu trong môi trường là 0,5x105 tế bào/ml; 1x105 tế bào/ml; 1,5x105 tế bào/ml; 2x105 tế bào/ml. Bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm xác định lượng tế bào tối ưu cho nuôi cấy Mật độ tế bào Thể tích Mật độ tế bào Thể tích
nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi 0,5x105 tế bào/ml
Thể tích nuôi cấy
10 lít 3
Xác định tỷ lệ tế bào bám
hạt sau 24 giờ nuôi cấy,
năng suất sinh sản của tế
bào sau 72 giờ.
1x105 tế bào/ml 1,5x105 tế bào/ml 2x105 tế bào/ml
3.5.1.3. Phương pháp xác định môi trường nuôi và pH môi trường nuôi
Để xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi tiến hành nuôi tế bào trên hệ thống với các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau như: Lactanbumin Hydrolysate (LH), Medium 199 (M199), Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bổ sung 5% huyết thanh+ 0,1% kháng sinh. Bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy Môi trường Môi trường
nuôi cấy
Sốlượng tếbào đầu
vào/10 lít môi trường
Số lần
lặp lại Chỉ tiêu theo dõi LH
1,5 x 109 3 lần
Xác định tỷ lệ hạt có tế bào
bám sau 24 giờ nuôi cấy, năng
suất sinh sản của tế bào sau 72 giờ nuôi cấy
M199
MEM
DMEM
Khi có kết quả xác định được loại môi trường nuôi cấy chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định pH môi trường nuôi cấy sử dụng để nuôi cấy tế bào PK 15 như dưới bảng 3.6.
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy pH của môi pH của môi
trường nuôi cấy
Sốlượng tế bào
đầu vào/10 lít
môi trường
Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi 7,0±0,1
1,5 x109 3 lần
Xác định tỷ lệ tế bào bám hạt
sau 24 giờ nuôi cấy, năng suất sinh sản của tế bào sau 72 giờ
7,2±0,1
7,4±0,1
3.5.1.4. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của tế bào PK 15
Để xác định thời gian nuôi cấy thích hợp tế bào PK 15 trên Microcarrier, chúng tôi tiến hành xác định đường cong sinh trưởng của tế bào PK 15 khi nuôi trên hệ thống Microcarrier quy mô 10 lít với các điều kiện đã được tối ưu ở các công việc trước đó: số tếbào đầu vào: 1,5 x 109 tế bào; pH = 7,0±0,1; môi trường nuôi MEM 5% FBS+KS; tốc độ khuấy = 50, DO= 50%, Lưu lượng khí =0,6 l/phút. Trên hệ thống nuôi cấy với thể tích 10 lít, sau 24, 48, 72, 96, 120, 144h nuôi cấy chúng tôi tiến hành lấy mẫu tách và đếm số lượng tế bào, lặp lại thí nghiệm 03 lần để xây dựng đường cong sinh trưởng trung bình của tế bào PK 15. Từđường cong sinh trưởng của tế bào PK 15 xác định được thời gian nuôi cấy tế bào thích hợp trước khi gây nhiễm vi rút DTL.
Các bước thực hiện trong nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier với thểtích 10 lít như sau:
*)Khôi phục tế bào:
chóng trong bểổn nhiệt 370C. Sau rã đông chuyển ống vào Laminar air flow (Laf) vô trùng, chuyển hỗn dịch tế bào vào ống ly tâm có chứa môi trường nuôi cấy đã được làm ấm của tế bào tương ứng. Ly tâm hỗn dịch tế bào trong khoảng 1500v/10 phút.
Sau ly tâm loại bỏ phần dịch nổi, giữ phần tế bào lắng cặn ở dưới. Hoàn nguyên bằng môi trường nuôi tế bào. Trộn đều bằng cách dùng pipet hút nhả.
Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào Tfask có môi trường nuôi dưỡng bổ sung huyết thanh và kháng sinh.
Ủ chai nuôi cấy ở tủấm 370C, 5% CO2.
Qua 1 ngày, loại bỏmôi trường nuôi dưỡng cũ để loại bỏ DMSO, rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS rồi cho môi trường nuôi dưỡng mới bổ sung huyết thanh. Ủ chai nuôi tế bào ở tủấm 370C, 5% CO2 để tế bào phát triển.
Hằng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi quang học.
*) Tách tế bào
Rửa chai tế bào bằng PBS(-): 1 – 2 lần. Cho TE 0,05%, láng chai Ủ 370C, 5 – 15 phút, cho tới khi tế bào co tròn, bắt đầu bong khỏi đáy chai, vỗ nhẹ chai nuôi, trung hòa bằng môi trường 5% huyết thanh. Đếm số tế bào trên buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào. Tính toán và chia tế bào ra các chai nuôi ở tủấm 370C.
Hàng ngày quan sát khảnăng phát triển của tế trong các chai tế bào trên kính hiển vi quang học.
Nhân sốlượng tế bào trên các chai nuôi cấy.
Để đủ số lượng tế bào PK 15 nuôi trên hệ thống Microcarrier với dung tích 10 lít, 30g hạt Cytodex-1, tế bào PK 15 cần phải được nhân theo từng cấp độ với quy mô lớn dần. Quy trình nhân sốlượng tếbào được mô tảtrong hình dưới đây:
*) Phương pháp đếm tế bào
Chuẩn bị buồng đếm
Dùng vải gạc sạch, tẩm cồn lau sạch buồng đếm và phiến kính đậy. Để buồng đếm và phiến kính đậy khô hoàn toàn (có thểhơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn).
Đặt buồng đếm trên mặt phẳng ngang rồi đặt phiến kính đậy vào vị trí buồng đếm. Chú ý không để phiến kính đậy bị lệch, kênh.
Hình 3.3. Buồng đếm tế bào
Trên buồng đếm tếbào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới. Mỗi vùng có 4 ô đếm.
Khi đếm, kết quảđếm được tính trên cả2 vùng đếm bao gồm 8 ô đếm.
1m 1m 1m
1
mm
Vùng đếm Ô đếm
Trong mỗi ô đếm, thứ tựđếm được mô tảnhư trên hình vẽ.
Tiến hành đếm số lượng tế bào sau đó tiến hành tính toán theo công thức
Công thức:
C Hệ số pha loãng tế bào A Số tếbào đếm lần 1 B Số tếbào đếm lần 2
16 Sốô đếm của 2 buồng (8 ô × 2 buồng đếm)
104 Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
V Thể tích bình nuôi cấy tế bào