Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thốngMicrocarrier
4.1.1. Nghiên cứu tốc độ khuấy và lưu lượng khí
4.1.1.1. Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Tốc độ khuấy nhanh hay chậm đều ảnh hưởng tới sự bám và phát triển tế bào trên bề mặt của các hạt Cytodex. Mặt khác, trong môi trường nuôi tế bào hay môi trường duy trì tế bào sau nhiễm đều có chứa một lượng huyết thanh nhất định khi tốc độ khuấy không thích hợp sẽ tạo ra bọt gây hiện tượng môi trường trào lên nắp ảnh hưởng đến vô trùng trong bình nuôi và sự phát triển của tế bào nên tìm ra được độ khuấy thích hợp là rất cần thiết.
Tiến hành thí nghiệm với 3 tốc độ khuấy 30rpm, 60rpm, 90rpm. Kết quảtheo dõi được trình bày bảng 4.1:
Bảng 4.1. Kết quảtheo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy Tốc độ khuấy Tốc độ khuấy
(Vòng/phút) 30 rpm 60 rpm 90 rpm
Khả năng lắng hạt lắng hạt nhanh không lắng không lắng
Tạo bọt môi trường không tạo bọt không tạo bọt tạo bọt
Độ bám tế bào (%) 24h 10- 20 20- 30 20- 30 48h 30- 40 50- 60 40- 50 72h 60- 70 80- 90 70- 80 96h 80- 90 100 100
Kết quả điều chỉnh tốc độ khuấy cho thấy: Điều chỉnh tốc độ khuấy 30 vòng/phút và 60 vòng/phút môi trường nuôi không tạo bọt tuy nhiên ở tốc độ khuấy 30 vòng/phút các hạt Cytodex bị lắng xuống đáy bình nhanh còn ở tốc độ khuấy 60 vòng/phút không bị lắng các hạt Cytodex xuống đáy bình.Ở tốc độ khuấy 90 vòng/phút các hạt Cytodex không bị lắng nhưng môi trường nuôi tạo bọt.
(1) (2)
Hình 4.1. (1) Bình nuôi có bọt, (2) bình nuôi cấy không có bọt
Độ bám tế bào ở từng tốc độ khuấy khác nhau cũng khác nhau.
•Ở tốc độ khuấy 30 vòng/phút sau 24 giờ nuôi tế bào bám và phát triển khoảng 10- 20%, đến 72 giờ nuôi tế bào bám khoảng 50-60% hạt Cytodex và sau 96 giờ nuôi tế bào PK 15 vẫn chưa bám kín hạt Cytodex khoảng 80-90%, phía đáy bình nuôi các hạt Cytodex lắng xuống có hiện tượng tế bào phát triển không đều.
•Ở tốc độ khuấy 60 vòng/phút tế bào bám và phát triển sau 24 giờ nuôi khoảng 20-30%, sau 72-96 giờ tế bào phát triển và bám kín hạt Cytodex 90-100%.
•Tốc độ khuấy 90 vòng/phút do tốc độ khuấy mạnh nên môi trường tạo bọt, tế bào bám và phát triển sau 24 giờ nuôi, sau 96 giờ nuôi tế bào bám kín hạt Cytodex, tuy nhiên mức độ bám tế bào trên hạt Cytodex không đều, hạt dày, hạt thưa tế bào.
Như vậy, tốc độ khuấy 60 vòng/phút không tạo bọt môi trường nuôi, không làm lắng hạt Cytodex xuống đáy bình, tế bào PK 15 phát triển và bám kín hạt Cytodex sau 72-96 giờ nuôi. Vậy nên chọn tốc độ khuấy 60 vòng/phút làm tốc độ khuấy cho các thí nghiệm tiếp theo của nuôi tế bào PK 15 trên hệ thốngMicrocarrier. Kết quả tốc độ phù hợp với nuôi cấy tế bào theo nghiên cứu của GE healthcare (Freshney, 2015).
4.1.1.2. Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
DO (Dissolved Oxygen) là nồng độ Oxy hòa tan trong nước, hàm lượng O2 trong nước hay môi trường nuôi rất cần thiết cho sự hô hấp của tế bào. Nồng độ oxy trong môi trường thấp sẽ gây ức chế và giảm sự phát triển của tế bào.
Tiến hành thí nghiệm với 4 mức độDO: 30%, 40%, 50%, 60%, lượng tế bào đầu vào cho 4 giá trị DO là: 1 x109 tế bào/30 gam Micro carrier/bình nuôi cấy 10 lít/giá trị DO.
Kết quả thí nghiệm trình bày bảng 4.2:
Bảng 4.2. Mức độ bám tế bào PK 15 vào hạt Cytodex ở các giá trị DO khác nhau
Thời gian theo dõi Mức độ bám tế bào PK 15 (%)
30 40 50 60
24 10-20 15-20 20-30 20-30
48 30-40 40-50 50-60 30-40
72 60-70 70-80 90-95 70-80
Kết quả theo dõi cho thấy mức độ bám và phát triển của tế bào PK 15 khác nhau ở các giá trị DO khác nhau, sau 24 giờ nuôi tế bào bắt đầu bám vào hạt Cytodex. Tuy nhiên, tế bào ở bình có giá trị DO=30-40% phát triển kém hơn (tế bào bám khoảng 10-20%) tế bào ở bình DO=50-60% (tế bào bám khoảng 20- 30%). Sau 72 giờ nuôi, DO=30-40% tế bào bám khoảng 70-80% trên bề mặt hạt Cytodex. Giá trị DO=50% sự nhân lên và phát triển của tế bào tốt hơn, bám gần hết kín hạt Cytodex khoảng 90-95%. Giá trị DO=60% sự nhân lên và phát triển của tế bào chậm hơn, bám 70-80% hạt Cytodex.
Sau 48 giờ nuôi tế bào, tiến hành lấy mẫu, tách tế bào xác định năng suất sinh sản của tế bào ở các giá trị DO khác nhau.
Kết quảtheo dõi đánh giá khảnăng phát triển của tếbào sau 48h như bảng 4.3:
Bảng 4.3. Kết quả theo dõi năng suất sinh sản của tế bào sau 48h nuôi cấy
Giá trị
DO (%)
Lô 01 Lô 02 Lô 03
Tỉ lệ sinh sản trung bình SLTB (×109) Tỉ lệ sinh sản của TB SLTB (×109) Tỉ lệ sinh sản của TB SLTB (×109) Tỉ lệ sinh sản của TB 30 1,8 1,8 1,7 1,7 1,6 1,6 1,7 40 2,0 2,0 1,9 1,9 2,1 2,1 2,0 50 2,5 2,5 2,6 2,6 2,5 2,5 2,53 60 2,3 2,3 2,4 2,4 2,3 2,3 2,33
Từ kết quả bảng 4.3 chúng tôi tiến hành dựng biểu đồ năng suất sinh sản của tế bào PK 15 tại thời điểm 48h nuôi ở các giá trịDO khác nhau như hình 4.3
Hình 4.3. Năng suất sinh sản của tế bào ở các giá trị DO khác nhau
Theo kết quả tại bảng 4.3 và hình 4.3 cho thấy:
Giá trị DO ảnh hưởng lớn của đến khảnăng sống và phát triển của tế bào cụ thể: với giá trịDO là 50% trong môi trường nuôi cấy sẽ cho khảnăng sống và tỷ lệ
sinh sản của tế bào cao nhất (2,53 lần). Trong khi lượng DO trong bình nuôi thấp (30-40%) làm cho quá trình sinh trưởng, trao đổi chất của các tế bào bị ức chế, tỉ lệ sinh sản của tế bào sau 48 giờ nuôi cấy kém (1,7 đến 2 lần). Bên cạnh đó, lượng DO cao 60% cũng không tốt cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, do lượng oxy hòa tan nhiều kết hợp với các chất thải ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào tạo ra nhiều CO2 gây độc cho tế bào. Tỷ lệ sinh sản của tế bào sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường có giá trị DO 60% chỉ đạt (2,33 lần). Từ những kết quả khảo sát trên, chúng tôi lựa chọn giá trị DO thích hợp cho nuôi cấy tế bào PK 15 là 50% với quy mô 10 lít.
4.1.1.3. Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Hệ thống khí gồm 4 khí O2, N2, CO2 và không khí đuợc phối trộn tự động rồi theo ống dẫn đi vào trong bình nuôi cấy. Hệ thống cho phép cài đặt lưu lượng khí thích hợp cho việc nuôi tếbào. Lưu lượng khí tối đa đi vào bình nuôi cấy là 1 lít/phút. Để xác định lưu lượng khi phù hợp, chúng tôi đã khảo sát các mức lưu lượng khi khác nhau cho bình nuôi cây thu được kết quảnhư bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quảđiều chỉnh lưu lượng khí cấp vào môi trường nuôi Lưu Lưu
lượng khí cấp vào
(lít/phút)
Lô 01 Lô 02 Lô 03
Tạo bọt Thời gian ổn định DO Tạo bọt Thời gian ổn định DO Tạo bọt Thời gian ổn định DO
0,2 Không 11h Không 11h Không 10h
0,4 Không 8h Không 10h Không 9h
0,6 Không 9h Không 8h Không 8h
0,8 Có 7h Có 8h Có 8h
Kết quả trên cho thấy, khi lưu lượng khí cấp vào trong bình nuôi cấy cao 0.8 lít/phút thời gian ổn định DO rút ngắn lại (7-8h), nhưng tạo bọt khí trong bình nuôi cấy. Trong khi đó, lưu lượng khí đưa vào thấp (0,2-0,3 lít/ phút) thì thời gian ổn định DO kéo dài (10-11 giờ).
Như vậy, lưu lượng khí cấp vào trong bình nuôi cấy PK 15 thích hợp là 0,6 lít/phút, thời gian ổn định DO dao động từ 8-9h.
Hình 4.4. Hệ thống khí đi vào hệ thống Microcarrier 4.1.2. Nghiên cứu số lượng đầu vào của tế bào 4.1.2. Nghiên cứu số lượng đầu vào của tế bào
Sau khi xác định được các thông số cài đặt hệ thống Microcarrier thích hợp nhất nuôi cấy tế bào PK 15, tiến hành xác định mật độđầu vào tế bào PK 15 thích hợp trên hệ thống Microcarrier 10 lít.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 3 lô liên tiếp, các kết quả thí nghiệm được tổng hợp như bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quảxác định sốlượng tế bào PK 15 thích hợp cho nuôi cấy
Mật độ tế bào
Lô 01 Lô 02 Lô 03
Năng suất sinh sản TB sau 72h % TB bám sau 24h Năng suất sinh sản sau 72h % TB bám sau 24h Năng suất sinh sản sau 72h % TB bám sau 24h Năng suất sinh sản sau 72h 0,5x105tế bào/ml 5-10 4,45 10-15 4,41 5-10 4,51 4,46±0,06 1x105tế bào/ml 10-15 4,56 20-25 4,62 15-20 4,49 4,56±0,07 1,5x105tế bào/ml 20-25 4,85 25-30 4,92 25-30 4,95 4,9±0,05 2x105tế bào/ml 30-35 3,89 30-40 3,95 35-40 3,95 3,93±0,03
Từ kết quả bảng 4.5 chúng tôi tiến hành dựng biểu đồ năng suất sinh sản của tế bào PK 15 tương ứng với từng mật độ tếbào đầu vào khác nhau như hình 4.5.
Hình 4.5. Năng suất sinh sản của tế bào PK 15 theo mật độ tếbào đầu vào khác nhau
Kết quả nghiên cứu cho thấy, mật độ tế bào đầu vào khác nhau ảnh hưởng đến tỷ lệ tế bào bám hạt sau 24h. Với mật độ 0,5 x 105 tế bào/ml, 1x105 tế bào/ml tỷ lệ hạt có tế bào bám và phát triển thấp tương ứng là (5-10%) và (15-20%) sau 24h. Đồng thời, có sự khác biệt tương đối lớn ở mật độ tếbào đầu vào là 2 x 105 tế bào/ml so với mật độ tếbào đầu vào 1,5x 105 tế bào/ml. Tỷ lệ tế bào bám hạt phát triển sau 24h khi nuôi với mật độ 2 x 105 tếbào/ml đạt 30-40%. Tuy nhiên, khi xác định năng suất sinh sản của tế bào sau 72h nuôi cấy thì số liệu lại trái ngược với tỷ lệ tế bào bám trên bề mặt hại Microcarrier tại thời điểm 24h. Nếu như tại thời điểm 24h nuôi cấy với mật độ tếbào đầu vào là 2x105 tế bào/ml tỏ ra ưu thếhơn với tỷ lệ tế bào bám hạt đạt đến 40% nhưng đến thời điêm 72h nuôi cấy năng suất sinh sản của tế bào chỉ đạt 3,93 lần. Trong khi đó, với mật độ tếbào đầu vào là 1,5x105 tế bào/ml tại thời điểm 24h tỷ lệ tế bào bám hạt chỉ đạt khoảng 25% nhưng đến thời điểm 72h nuôi cấy, năng suất sinh sản của tế bào lại đạt 4,9 lần.
Điều này có thểđược giải thích như sau: với mật độ tế bào đầu vào là 2x105 tế bào/ml thì sốlượng tếbào ban đầu vào nhiều hơn số hạt nên có rất nhiều tế bào bám trên bề mặt của cùng một hạt dẫn đến tỷ lệ tế bào bám hạt cao ngay từ đầu. Tuy nhiên vì số tế bào nhiều hơn số hạt nên cũng có rất nhiều tế bào không có bề mặt để bám nên không sinh trưởng, phát triển được. Do đó tại thời điểm 72h sau
nuôi cấy năng suất sinh sản của tế bào không cao. Bên cạnh đó, với mật độ tế bào đầu vào là 1,5x105 tế bào/ml, số lượng tế bào tương thích với số lượng hạt Microcarrier nên hầu hết tế bào đều bám lên bề mặt các hạt Microcarrier và sinh trưởng phát triển được nên đến thời điểm 72h sau nuôi cấy năng suất sinh sản của tếbào đạt cao nhất gấp 4,9 lần tếbào ban đầu.
Từ những kết quả trên chúng tôi lựa chọn mật độ tế bào PK 15 cấy vào Microcarrier là 1,5 x 105 tế bào/ml.
Dưới đây là một số hình ảnh nuôi tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
Hình 4.6. Hình ảnh tế bào PK 15 trên Microcarrier
(a. Hình ảnh tế bào 24h; b. Hình ảnh tế bào 48h; c. Hình ảnh tế bào 72h; d. Hình ảnh tế bào 96h)
4.1.3. Xác định môi trường nuôi cấy và pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier thống Microcarrier
4.1.3.1. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Năng suất sinh sản tế bào ảnh hưởng trực tiếp bởi môi trường nuôi không thích hợp. Để tìm ra công thức môi trường nuôi tối ưu nhất cho sự phát triển cũng như sự nhân của tế bào, tiến hành thí nghiệm nuôi cấy tế bào PK 15 trên 4 công thức môi trường khác nhau là MEM 5%FBS+KS, DMEM 5%FBS+KS, M199 5%FBS+KS và LH 5%FBS+KS. Sau 3 lô thử nghiệm liên tiếp với 4 loại môi trường nuôi cấy khác nhau, chúng tôi thu được các kết quả nghiên cứu như bảng 4.6
Bảng 4.6. Khả năng bám và phát triển tế bào PK 15 trên các loại môi trường Thời gian Thời gian theo dõi Mức độ bám tế bào PK 15 (%) MEM 5%FBS+KS DMEM 5%FBS+KS M199 5%FBS+KS LH 5%FBS+KS 24 20-30 10-20 10-20 10-20 48 60-70 50-60 40-50 30-40 72 90-100 70-80 60-70 50-60 96 100 90-100 80-90 80-90
Qua quá trình theo dõi ở cả 4 loại môi trường nuôi:
MEM 5% FBS+KS, DMEM 5% FBS+KS tế bào PK 15 sau 72-96 giờ nuôi tế bào bám kín tất cả các hạt Cytodex.
M199 5% KS và LH 5%FBS+KS tế bào PK 15 sau 96 giờ chỉ phủ 80- 90% hạt Cytodex.
Hiện tại, hệ thống nuôi trên chai T-fask 225cm2 chúng tôi đang sử dụng môi trường MEM 5% FBS+KS, nuôi 72 giờ, cho năng suất nhân là 5 lần.
Theo dõi thí nghiệm, tiến hành lấy mẫu theo dõi mức độ phát triển của tế bào trên kính hiển vi và đếm số tế bào sau 72 giờ. Kết quả thu được năng suất nhân của tế bào PK 15 trên từng loại môi trường nuôi khác nhau.
Bảng 4.7. Bảng năng suất tế bào PK 15 trên các loại môi trường tại thời điểm 72h nuôi cấy
Môi
trường
Lô 01 Lô 02 Lô 03
NSSS trung bình SLTB (×109) NSSS của TB SLTB (×109) NSSS của TB SLTB (×109) NSSS của TB LH 3,3 2,20 3,6 2,40 3,54 2,36 2,32±0,11 M199 4,95 3,3 5,07 3,38 4,86 3,24 3,31±0,07 DMEM 5,25 3,50 5,43 3,62 5,37 3,58 3,57±0,06 MEM 6,33 4,22 6,45 4,30 6,27 4,18 4,23±0,06
Từ kết quả bảng 4.7, tôi tiến hành dựng biểu đồ thể hiện năng suất sinh sản của tế bào tại thời điểm 72 giờdưới hình 4.7.
Hình 4.7. Năng suất sinh sản của tếbào trên các môi trường nuôi
Mỗi một loại tế bào khác nhau sẽ phù hợp với các công thức môi trường nuôi khác nhau, cho nên phải tìm công thức môi trường nuôi thích hợp và tối ưu nhất cho tế bào. Lựa chọn được môi trường tối ưu nhất cần đủ hai yếu tố: tốc độ phát triển và năng suất nhân lên của tế bào. Từ kết quả bảng 4.6 và 4.7 môi trường MEM là môi trường nuôi tế bào PK 15 có tốc độ phát triển nhanh và mạnh nhất (sau 72 giờ nuôi tếbào bám 100%) và năng suất nhân lên của tế bào cao nhất (4,23 lần).
Sử dụng phần mềm Minitab 16 (ANOVA) nhận thấy P< 0,005; chúng tôi lựa chọn môi trường MEM bổsung 5% FBS và kháng sinh là môi trường nuôi tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.3.2. Xác định môi pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Kết quả khảo sát sựảnh hưởng của pH đến khả năng bám hạt của tế bào PK 15 và năng suất sinh sản của tế bào qua 3 lô thí nghiệm được chúng tôi tổng hợp như bảng 4.8.
Bảng 4.8. Kết quảxác định tỉ lệ hạt có tế bào bám sau khi nuôi cấy 24h với các điều kiện pH khác nhau
pH
Lô 01 Lô 02 Lô 03
Tỷ lệ hạt có TB