2.3.8. Phòng và kiểm soát bệnh
2.3.8.1.Phòng bệnh
Bệnh do PEDV là một bệnh do nhiều yếu tố gây ra nên việc phòng và kiểm soát bằng cách sử dụng vaccine PEDV. Tiêm vaccine đƣợc báo cáo là cải thiện tăng trọng bình quân trên ngày và chuyển đổi thức ăn, giảm chi phí thuốc men và giảm lƣợng virus và tổn thƣơng do PEDV gây ra. Ở lợn nái tiêm vaccine làm tăng chất lƣợng đàn lợn con rõ rệt.
Tại Nhật Bản, từ năm 1997 đã có vaccine nhƣợc độc chủng P-5V thích ứng trên môi trƣờng tế bào đƣợc đƣa vào trong phòng bệnh đã đạt đƣợc hiệu
quả cao. Tại Hàn Quốc, loại vaccine phòng bệnh PEDV chế từ DR13 nhƣợc độc (thu đƣợc sau khi cấy truyền chủng cƣờng độc 100 đời) đã đƣợc nghiên cứu và đƣa ra sản xuất. Kết quả thử nghiệm cho thấy loại vaccine này đƣa theo đƣờng miệng thì hiệu quả hơn tiêm. Đặc biệt, virus vaccine có độ ổn định và an toàn cao, virus vaccine đem cấy truyền 3 đời trên lợn vẫn duy trì đƣợc độ an toàn khi tiêm phòng cho lợn. Ngoài ra, tỷ lệ tử vong ở lợn con do PEDV giảm xuống khi cho lợn nái mang thai uống virus dòng DR13. Hiệu quả kháng thể trong huyết thanh cao hơn sẽ làm cho thời gian bài thải virus ngắn hơn, giảm mức độ trầm trọng và thời gian tiêu chảy của lợn con thấp hơn, việc bảo hộ hoàn toàn khỏi sự xâm nhiễm PEDV giúp phòng chống lại sự bài thải virus khi lợn tiếp xúc với virus cƣờng độc. Khi cho lợn con uống PEDV nhƣợc độc, miễn dịch tạo đƣợc chỉ phần nào bảo vệ đƣợc chúng trƣớc thử thách từ các chủng cƣờng độc, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy mức độ bảo hộ liên quan mật thiết tới liều virus đƣợc uống.
Một số cơ sở chăn nuôi đã có biện pháp phòng bệnh PEDV trên lợn khá hiệu quả và đã giảm đƣợc thiệt hại chăn nuôi bằng cách: Tự tạo miễn dịch cho lợn con bằng cách cho lợn mẹ ăn ruột của lợn con trƣớc khi đẻ là một biện pháp phòng bệnh có hiệu quả.
Phƣơng pháp tiến hành:
Lấy ruột 2-3 lợn con dƣới 5 ngày tuổi có triệu chứng ỉa chảy do PEDV đang còn sống, chƣa đƣợc điều trị thuốc, cho vào máy xay sinh tố xay nhỏ.
Trộn hỗn hợp thu đƣợc với 1.000ml nƣớc cất. Lọc qua vải gạc lấy phần nƣớc trong cho vào 100g Colistin để diệt tạp khuẩn. Đem dung dịch trên trộn với thức ăn trong toàn trại cho lợn nái, lợn hậu bị ăn (mỗi con 10ml). Sau khi ăn nếu lợn xuất hiện triệu chứng ỉa chảy hoặc ủ rũ, bỏ ăn là đạt yêu cầu, nếu không phải làm lại.
Sau 2 tuần kháng thể mới xuất hiện, vì vậy đối với lợn nái mang thai tuần 15 – 16, lợn con sinh ra vẫn chết vì PEDV.
Nếu phát hiện, xử lý nhanh có thể sau 3 tuần đáp ứng miễn dịch bệnh trong toàn trại (Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs, 2011)8.2. Kiểm soát bệnh
Hiện nay bên cạnh việc quản lý trại, nâng cao hiểu quả sản xuất thì việc kiểm soát dịch bệnh cũng rất đƣợc lƣu tâm. Trƣớc đây mọi ngƣời chú trọng đến
việc điều trị mà chƣa coi trọng việc phòng dịch. Mà trong chăn nuôi luôn có phƣơng châm phòng hơn chống, do vậy vấn đề phòng dịch cho trại chăn nuôi rất quan trọng.
Nguyên tắc cơ bản trong phòng chống dịch bệnh
a. Hạn chế tiếp xúc với lợn:
Bệnh dịch xảy ra lây lan vào trại có một số nguyên nhân do động vật hoang dã, côn trùng, gió… nhƣng nguyên nhân chính vẫn do con ngƣời, phƣơng thức vận chuyển, phƣơng thức chăn nuôi, các dụng cụ trong chăn nuôi, phân hoặc con ngƣời cũng có thể là vật chủ trung gian lây bệnh gây ra. Chính vì vậy, trại chăn nuôi lợn phải đƣợc xây dựng các biện pháp cách ly hiệu quả, khống chế tại cửa ra vào, hạn chế tối đa việc tiếp xúc với lợn.
b. Luôn kiểm soát các nguyên nhân gây stress cho lợn:
Khi stress con vật sẽ dễ mắc bệnh. Không chỉ các yếu tố thông thƣờng gây stress nhƣ nhiêt độ, độ ẩm, nồng độ khí độc trong chuồng nuôi mà mật độ nuôi cao trong quy mô công nghiệp nhƣ hiện nay, hệ thống miễn dịch lợn giảm sút không bảo vệ đƣợc sự tấn công của vi khuẩn gây stress. Do vậy chúng ta phải luôn theo dõi và tìm ra những biện pháp sao cho lợn tránh đƣợc tối đa các nguyên nhân gây stress.
c. Vệ sinh- Sát trùng:
Vệ sinh các thiết bị dụng cụ trong chăn nuôi, đều đăn kiểm tra dụng cụ từng ngày xem đạt yêu cầu vệ sinh hay chƣa. Cần sát trùng đúng nồng độ, thuốc sát trùng sao cho hiệu quả sát trùng đạt cao nhất, vệ sinh sát trùng chuồng trại thƣờng xuyên, theo chu kỳ sản xuất và đúng quy trình kỹ thuật. Khi bệnh dịch xảy ra cần phải vệ sinh sát trùng kỹ càng hơn và thƣờng xuyên hơn từ trong ra ngoài trại. Tất cả mọi ngƣời phải có ý thức trong vệ sinh phòng chống dịch.
d. Dinh dưỡng phải được chú trọng:
Phải cho lợn con đƣợc bú sữa đầu (colostrums) vì kháng thể chỉ đƣợc sản sinh trong khoảng 24 giờ đầu sau khi lợn mẹ sinh con và hơn nữa khả năng hấp thụ sữa đầu trong 24 giờ đầu của lợn con là tốt nhất, trong sữa đầu có nhiều vitamin A, nhiều protein mà đặc biệt là gamma globulin (một loại kháng thể) của nái mẹ truyền cho con, giúp lợn con có kháng thể để kháng bệnh trong thời kỳ bú mẹ. Để nâng cao hệ miễn dịch cần tiếp tục bổ sung khoáng chất, vitamin, chất chống oxy hóa với liều phù hợp cho từng lứa tuổi của lợn.
2.3.9. Phƣơng pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức
Phƣơng pháp nuôi cấy virus trên môi trƣờng tế bào, tổ chức là phƣơng pháp khoa học tiên tiến đƣợc sử dụng rộng rãi trong virus học để nghiên cứu về virus nhƣ : nuôi cấy, phân lập, giám định, chuẩn độ, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt dùng các môi trƣờng tế bào, tổ chức để nuôi cấy các virus vacxin.
Muốn nuôi cấy đƣợc virus trên môi trƣờng tế bào thì yêu cầu trƣớc tiên là tế bào phải có thụ thể phù hợp với virus. Nhờ đó, virus mới xâm nhập vào liên kết và lợi dụng bộ máy di truyền của tế bào để nhân lên.
Với nhiều loại virus sự nhân lên của chúng tiến triển song song với sự thoái hóa của các tế bào nuôi, một số virus gây bệnh cho tế bào rất đặc trƣng. Những biến đổi có tính chất đặc trƣng đó gọi là sự hủy hoại của tế bào chủ hay bệnh tích tế bào (Cyto Pathogenic Effect-CPE) hoặc các ổ tế bào bị hoại tử. Mỗi ổ của tế bào bị hoại tử đó đƣợc gọi là một đơn vị plague xuất hiện. Có những tế bào bị nhiễm virus chƣa đến mức bị chết nhƣng chức năng của tế bào này đã bị thay đổi.
Căn cứ vào CPE khi quan sát trên kính hiển vi soi nổi có thể đánh giá đƣợc hiệu quả phân lập, nuôi cấy virus.
Tế bào Vero có thể phân lập đƣợc các chủng PEDV, hơn nữa thời gian và mức độ gây bệnh tích tế bào, số lƣợng virus thu đƣợc sau khi phân lập đều đảm bảo yêu cầu nên dòng tế bào này đƣợc ứng dụng nhiều cho chẩn đoán và nghiên cứu.
Để nghiên cứu PEDV thƣờng dùng môi trƣờng tế bào Vero. Tế bào Vero là tế bào có thụ thể phù hợp với virus PEDV nên virus sau khi xâm nhập vào tế bào nhờ các receptor phù hợp với cấu trúc của virus trên bề mặt tế bào, chúng thực hiện quá trình nhân lên và phá hủy các tế bào này. Chính vì vậy, nó là tế bào thích hợp để sử dụng trong phân lập và hiệu giá virus.
2.3.10. Định lƣợng virus
Định lƣợng virus là xác định số lƣợng virus trong một đơn vị cụ thể để xác định nồng độ virus. Đây là một biến quan trọng trong việc sản xuất vacxin, sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách sử dụng vecter virus, nghiên cứu về đặc tính sinh học hay những nghiên cứu khác về virus. Virus đƣợc định lƣợng và điều
chỉnh ở MOI (Multiplicity Of Infection) nhất định để tối ƣu hóa sản lƣợng sản xuất và đáp ứng nhu cầu thay đổi không ngừng các ứng dụng khác.
Trong nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus, định lƣợng virus xác định TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose-liều gây nhiễm 50% tế bào) có vai trò quan trọng trong việc xác định lƣợng virus cần dùng để gây nhiễm tại MOI thích hợp, đảm bảo việc so sánh đặc tính sinh trƣởng của các virus khác nhau một cách khách quan và chính xác. Ở các bƣớc tiếp theo, xác định quy luật nhân lên của virus trên môi trƣờng tế bào, log10TCID50 là biến số để xây dựng.
TCID50 là một biến số sử dụng phổ biến thể hiện định lƣợng của virus, là số virus cần thiết để gây ra 50% CPE cho môi trƣờng tế bào gây nhiễm virus. Khảo nghiệm về TCID50 đƣợc ứng dụng phổ biến trong các nghiên cứu lâm sàng phải xác định liều gây chết của virus. Khi sử dụng cho nuôi cấy tế bào, các tế bào đƣợc ủ với virus để virus gây nhiễm và nhân lên thêm. Sau đó, căn cứ vào tỷ lệ chết của tế bào bị nhiễm virus ở những giếng có độ pha loãng virus khác nhau mà tính toán ra TCID50.
MOI (Multiplicity Of Infection) là tỷ lệ giữa tác nhân gây nhiễm với đích gây nhiễm. Trong trƣờng hợp gây nhiễm virus vào tế bào thì MOI lúc này đƣợc xác định là tỷ lệ giữa lƣợng virus và số tế bào trong một
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu đƣợc thực hiện trên lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội dƣơng tính với virus PEDV.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Đặc tính sinh học 3.2.1. Đặc tính sinh học
- Xác định các mẫu lợn Yorkshine dƣơng tính với virus PEDV. - Phân lập các chủng PEDV trên môi trƣờng tế bào.
- Xác định hiệu giá virus của các chủng PEDV phân lập.
- Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của chủng PEDV phân lập trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero.
3.2.2. Đặc điểm gây bệnh
- Xác định triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus).
- Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus).
- Xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus ).
3.3. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian: Từ ngày 6/7/2015 đến ngày 31/08/2016.
3.4. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, MÁY MÓC 3.4.1. Nguyên liệu 3.4.1. Nguyên liệu
- Các lợn Yorkshire mắc bệnh PEDV nuôi ở một số trang trại tại vùng phụ cận Hà Nội .
- Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy trên khay nuôi tế bào hoặc đĩa lồng.
3.4.2. Hóa chất
- Hóa chất sử dụng trong làm tiêu bản vi thể: dung dịch focmon 10%, xylem, thuốc nhuộm HE, Baume Canada, NaHCO3 1%, focmon10%, cồn, Xylen, Ethanol (96-100°), paraffin, PBS, DAB…
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trƣờng nuôi cấy DMEM (Dulbecc’s Modified Eagle Medium), FBS (Fetal bovine serum), kháng sinh ( penicillin (100 UI/ml), streptomycin (100 pg/ml)), …
3.4.3. Máy móc dụng cụ
- Máy móc: Kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy chạy điện di, máy PCR, máy đục khuôn mẫu, máy cắt tiêu bản (Microtom), máy chụp gel, cân điện, lò vi sóng, máy PCR , box vô trùng, tủ ấm 37°C/5% CO2, tủ sấy, tủ lạnh - 20°C, tủ lạnh -80°C, bình nitơ lỏng, máy ly tâm lạnh, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh,…
- Dụng cụ sử dụng : Dao, kéo, panh kẹp, khay, eppendorf, bông cồn, lamen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, panh, dao, kéo, cƣa, cốc đong hóa chất, đèn cồn, ống nghiệm, lọ đựng formol 10%, bình nuôi cấy tế bào, khay 96 giếng, khay 24 giếng, đĩa lồng, pipet,…
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng 3.5.1. Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng
Phƣơng pháp quan sát triệu chứng lâm sàng của lợn Yorkshire nghi mắc PEDV ngay từ khi lợn Yorkshire xuất hiện những dấu hiệu đầu tiên. Đồng thời kết hợp giữa đặc điểm dịch tễ địa phƣơng với việc thu thập thông tin từ chủ gia súc và cán bộ thú y để tăng độ tin cậy chẩn đoán.
Quan sát biến đổi đại thể thông qua việc mổ khám những lợn Yorkshire có triệu chứng lâm sàng của PEDV.
3.5.2. Phƣơng pháp mổ khám
Để xác định đƣợc các biến đổi đại thể của các cơ quan ở lợn Yorkshire nghi mắc PEDV cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng đặc trƣng của bệnh. Quá trình mổ khám tuân theo quy trình mổ khám TCVN-TC16-2005.
3.5.3. Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
Các mẫu đƣợc lấy theo quy định của ngành: Mẫu cơ quan, tổ chức cần lấy đúng (lấy đứng cơ quan, đúng vùng tổn thƣơng điển hình); lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lƣợng cần thiết).
3.5.4. Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT- PCR
a. Chuẩn bị mẫu cho phản ứng RT-PCR
Lấy bệnh phẩm từ tủ âm sâu để cho tan đá.
Nghiền bệnh phẩm: cắt nhỏ bệnh phẩm cho vào Eppendorf 1,5ml nghiền nát bệnh phẩm với môi trƣờng DMEM thành huyễn dịch đồng nhất. Sau đó đem ly tâm bỏ phần cặn. Phần dung dịch thu đƣợc bảo quản ở -80°C cho đến khi sử dụng.
Lƣu ý: Tất cả các thao tác đƣợc tiến hành trong buồng cấy vô trùng các hóa chất đƣợc sử dụng đều vô trùng, các dụng cụ đƣợc sử dụng đều phải đƣợc hấp vô trùng trƣớc và sau khi sử dụng.
b. Tách chiết RNA virus bằng KIT QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất Kit. 1. Hút 560 µl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
2. Thêm 140 µl dung dịch mẫu đã xử lý là hỗn dịch (chứa virut và dung dịch PBS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau đó lắc đều nhanh trong 15 giây rồi để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
3. Thêm 560 µl dung dich Ethanol (96-100°), lắc đều nhanh trong 15 giây. 4. Chuyển 630 µl huyễn dịch trên sang cột QIAamp spin. Ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ nƣớc dƣới.
5. Lặp lại bƣớc 4.
6. Thêm 750 µl dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút rồi giữ cột, bỏ nƣớc dƣới.
7. Thêm 750 µl dung dịch AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút, giữ cột, bỏ nƣớc dƣới. Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 13000 vòng/phút trong 1 phút.
8. Chuyển cột sang một ống Eppendorf mới. Thêm 60 µl dung dịch AVE, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 rồi bỏ cột, giữ nƣớc dƣới, dung dich ở dƣới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Kí hiệu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -70°C.
c. Cách tiến hành chạy RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ đƣợc hỗn hợp với các thành phần đƣợc trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) 2X Reaction Mix 12.5 Mẫu RNA 5 Primer Forwad 0.5 Primer Reverse 0.5 Enzyme Taq 0.5
Nƣớc khử ion (DEPC – treated) 6
Tổng thể tích 25
Cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng này phát hiện đoạn gen S của virus PED.
Tên mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ Kích thƣớc
Mồi xuôi PS1 TTCTGAGTCACGAACAGCCA 651bp Mồi ngƣợc PS2 CATATGCAGCCTGCTCTGAA
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bƣớc tổng hợp Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1
Duỗi mạch 95 2 phút
2 Duỗi mạch 95 30 giây 35
Gắn mồi 55 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 60 giây
3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
d. Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả
Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel đƣợc chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 100°C trong 5 phút, để nguội 45-50°C bổ sung
03µl Ethidium bromide (nồng độ 10µg/10µl). Sau đó đổ vào khuôn có các lƣợc đƣợc cài sẵn để tạo bản gel. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di