Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1.3. Xác định hiệu giá của chủng virus phân lập đƣợc
Sau khi phân lập đƣợc 4 chủng virus PEDV dùng để nghiên cứu, tiếp tục tiến hành tìm hiểu đặc tính sinh học của chúng qua việc xác định hiệu giá virus. Tiến hành chuẩn bị một khay 96 giếng đã phủ tế bào Vero một lớp (tế bào phủ kín thành một lớp trên bề mặt nuôi cấy, không chồng chéo lên nhau). Số lƣợng tế bào trong một giếng của khay đƣợc xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình (phƣơng pháp đƣợc trình bày ở phần 3.5.6). Huyễn dịch virus đƣợc pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp của các giếng theo thứ tự đánh dấu trƣớc (25 µl/giếng), mỗi độ pha lỗng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, bổ sung vào mỗi giếng 100 µl dung dịch duy trì DMEM có chứa 10% TBP. Để khay tế bào đã gây nhiễm virus trong tủ ấm 37°C/5% CO2.
Quan sát CPE sau 5 ngày gây nhiễm qua các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60 giờ…. Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV khi quan sát tế bào sau khi gây nhiễm tại các thời điểm bằng kính hiển vi soi nổi. Mức độ CPE đƣợc tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích có bệnh tích tế bào so với tổng diện tích tế bào trong bình. CPE đạt 100% khi bệnh tích xuất hiện trên cả bề mặt tế bào nuôi cấy một lớp, 0% khi chƣa có bệnh tích tế bào. Từ đó xác định tƣơng đối mức độ bệnh tích. Chẳng hạn, CPE đạt 25% khi quan sát trong tồn bộ mơi trƣờng ni cấy, bệnh tích tế bào xuất hiện trên ¼ diện tích.
Sau đó virus đƣợc thu hoạch và xác định TCID50 theo phƣơng pháp Reed- Muench. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả xác định hiệu giá virus của các chủng virus PEDV phân lập đƣợc
STT Chủng virus TCID50/25µl
1 PEDV-01 104.48
2 PEDV-02 104.25
3 PEDV-03 105.50
4 PEDV-04 104.74
Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy hiệu giá virus thấp nhất đƣợc xác định là chủng virus PEDV-02 với giá trị 104.25 TCID50/25µl, hiệu giá cao nhất đƣợc xác định là chủng virus PEDV-03 với giá trị 105.50TCID50/25µl. Các chủng virus PEDV có hiệu giá tƣơng đối cao, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trƣờng tế bào Vero sẽ đƣợc lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu các đặc tính sinh học sâu hơn.