Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1.4. Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV
Tiến hành nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng virus PEDV phân lập đƣợc qua việc đánh giá khả năng nhân lên của virus trên môi trƣờng tế bào Vero.
Để đánh giá một cách khách quan đặc tính sinh trƣởng, phát triển của virus, đầu tiên các huyễn dịch chứa virus đƣợc đem hiệu giá để tính tốn giá trị TCID50. Sau đó mới đem gây nhiễm lên môi trƣờng tế bào Vero ở cùng một tỷ lệ MOI=0,1.
Tiến hành chuẩn bị một khay 96 giếng tế bào Vero đã mọc đều kín một lớp trên bề mặt nuôi cấy. Số lƣợng tế bào trong một giếng của khay đƣợc xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình. Sau đó, huyễn dịch chứa virus đƣợc đƣa vào gây nhiễm cho các giếng tế bào theo lƣợng thích hợp để đảm bảo MOI=0,1. Khay tế bào gây nhiễm virus đƣợc ủ ở 37°C/5% CO2 để theo dõi CPE qua các thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ,
60 giờ,… sau gây nhiễm cho đến khi CPE khơng cịn phát triển thêm trên các giếng tế bào nữa.
Kết quả theo dõi sự nhân lên của các chủng virus phân lập đƣợc qua sự phát triển bệnh tích tế bào trên môi trƣờng tế bào Vero đƣợc thể hiện ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Bệnh tích tế bào khi gây nhiễm các chủng virus PEDV phân lập
Mẫu PEDV-01 PEDV-02 PEDV-03 PEDV-04
CPE theo thời gian sau
khi gây nhiễm virus 24h - - + - 36h + + + + 48h ++ ++ ++ ++ 60h ++ ++ ++ ++ 72h ++ ++ +++ ++ 84h +++ +++ B +++ 96h B B B Ghi chú:
PEDV-01, PEDV-02, PEDV-3, PEDV-04: kí hiệu các chủng virus phân lập đƣợc
Khơng có bệnh tích -
5-10% tế bào có bệnh tích +
20-70% tế bào có bệnh tích ++
80-100% tế bào có bệnh tích +++
Tồn bộ tế bào bong tróc khỏi bề mặt ni cấy B
Phân tích bảng 4.6 cho thấy mẫu virus nghiên cứu đƣợc phân lập từ các lợn khác nhau có khả năng phát triển, nhân lên tƣơng đối giống nhau về qua trình xâm nhập và nhân lên trên môi trƣờng tế bào Vero. Các tế bào bị nhiễm virus PEDV co cụm lại với nhau chồi lên khỏi đáy bình ni cấy và khi tế bào bị virus
phá hủy hồn tồn thì bong khỏi đáy bình, có thể quan sát ró hình thái bệnh tích này qua kính hiển vi soi ngƣợc. Bệnh tích tế bào bắt đầu xuất hiện sau 24 giờ gây nhiễm là sớm nhất với chủng PEDV-03 (hình 4.6), số lƣợng tế bào phá hủy tăng dần sau 48 giờ gây nhiễm đạt từ 30% -50% (hình 4.7), đạt xấp xỉ 70%-80% ở thời điểm 60 giờ sau gây nhiễm virus PEDV-03. CPE đạt 100% đƣợc ghi nhận ở thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm virus PEDV-03 (hình 4.8), đến 84 giờ sau gây nhiễm virus PEDV-03 các tế bào đều bị tan vỡ bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy (hình 4.9).
MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH TÍCH TẾ BÀO CỦA CÁC VIRUS PEDV PHÂN LẬP
Hình 4.6. Bệnh tích tế bào ở 24h – PEDV – 03 Hình 4.7. Bệnh tích tế bào ở 48h – PEDV – 03 Hình 4.8. Bệnh tích tế bào ở 72h – PEDV – 03 Hình 4.9. Bệnh tích tế bào ở 84h – PEDV – 03
Khác với chủng PEDV-03, các chủng PEDV-01, PEDV-02, PEDV-04 lại quan sát thấy bệnh tích tế bào xuất hiện muộn hơn (bệnh tích tế bào bắt đầu
xuất hiện sau 36 giờ gây nhiễm) và tăng chậm trong các thời gian tiếp theo. Sau 48 giờ gây nhiễm, CPE do 3 chủng gây ra đạt từ 20-30%, đạt từ 30-50% ở thời điểm 60 giờ sau gây nhiễm. Sau 72 giờ gây nhiễm, CPE do 3 chủng gây ra đạt xấp xỉ 75-80%, ít hơn hẳn so với CPE đƣợc gây ra bởi chủng PEDV-03. Đạt 100% CPE đƣợc ghi nhận ở thời điểm 84 giờ sau gây nhiễm và đến 96 giờ toàn bộ tế bào bị tan vỡ bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy, chậm hơn 12 giờ so với chủng PEDV-03.
Nhƣ vậy mỗi chủng PEDV phân lập đƣợc, thời điểm xuất hiện bệnh tích tế bào cũng nhƣ phá hủy tồn bộ tế bào Vero có khác nhau, điều này phản ánh sự khác nhau về khả năng nhân lên và phá hủy tế bào Vero của các chủng virus phân lập đƣợc.