Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.5.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào
Để chuẩn bị các bƣớc nghiên cứu tiếp theo, cần phải chuẩn bị lƣợng tế bào Vero cần thiết.
a. “Gọi” tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng DMEM bổ sung 5% FBS làm ấm trong tủ 37°C trong 30 phút, trƣớc khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bƣớc 1: Giải đơng tế bào ở nhiệt độ phịng.
Bƣớc 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bƣớc 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM bổ sung 5% FBS, chuyển tế bào vào bình ni cấy chứa 5ml mơi trƣờng DMEM bổ sung 5% FBS.
Bƣớc 4: Giữ tế bào ở tủ ấm 37°C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình ni cấy mới.
b. Cấy chuyển tế bào
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lƣợng tế bào lên một lƣợng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bƣớc 1: Loại bỏ môi trƣờng đang nuôi dƣỡng, rửa tế bào bằng dung dịch PBS (không chứa Ca2+ hoặc Mg2+).
Bƣớc 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trysin-EDTA.Thêm 7ml môi trƣờng không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bƣớc 3: Loại bỏ Trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bƣớc 4: Cân bằng mơi trƣờng và đếm số tế bào, hịa tan tế bào trong 6ml môi trƣờng đầy đủ. Đếm tế bào, pha lỗng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990 µl mơi trƣờng khơng đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
Bƣớc 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào 2.105
tế bào/ml trong môi trƣờng đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình ni cấy mới (6 ml/bình T25, 15 ml/bình T75).
Bƣớc 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37°C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
c. Thu tế bào
Sau khi có đủ số lƣợng tế bào cần thiết, tế bào đƣợc thu và bảo quản để tiếp tục sử dụng những lần khác. Mỗi tế bào thƣờng có một giới hạn nhất định về số lần nuôi cấy, thực chất là số lần phân chia tế bào, trừ tế bào ung thƣ có khả năng phân chia vơ hạn. Vì thế, trong các lần cấy chuyển và thu hoạch cần ghi hồ sơ theo dõi tế bào để đảm bảo chất lƣợng tế bào cho nghiên cứu.
Các bƣớc thu tế bào giống với các bƣớc cấy chuyển tế bào, chỉ khác ở bƣớc 5 và bƣớc 6.
Bƣớc 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5.106 tế bào/ml trong môi trƣờng đầy đủ có bổ sung DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1ml/ống.
Bƣớc 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20°C trong 2-3 giờ, chuyển sang -80°C qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nito lỏng.