Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.5.4. Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
a. Chuẩn bị mẫu cho phản ứng RT-PCR
Lấy bệnh phẩm từ tủ âm sâu để cho tan đá.
Nghiền bệnh phẩm: cắt nhỏ bệnh phẩm cho vào Eppendorf 1,5ml nghiền nát bệnh phẩm với môi trƣờng DMEM thành huyễn dịch đồng nhất. Sau đó đem ly tâm bỏ phần cặn. Phần dung dịch thu đƣợc bảo quản ở -80°C cho đến khi sử dụng.
Lƣu ý: Tất cả các thao tác đƣợc tiến hành trong buồng cấy vơ trùng các hóa chất đƣợc sử dụng đều vô trùng, các dụng cụ đƣợc sử dụng đều phải đƣợc hấp vô trùng trƣớc và sau khi sử dụng.
b. Tách chiết RNA virus bằng KIT QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất Kit. 1. Hút 560 µl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
2. Thêm 140 µl dung dịch mẫu đã xử lý là hỗn dịch (chứa virut và dung dịch PBS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau đó lắc đều nhanh trong 15 giây rồi để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
3. Thêm 560 µl dung dich Ethanol (96-100°), lắc đều nhanh trong 15 giây. 4. Chuyển 630 µl huyễn dịch trên sang cột QIAamp spin. Ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ nƣớc dƣới.
5. Lặp lại bƣớc 4.
6. Thêm 750 µl dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút rồi giữ cột, bỏ nƣớc dƣới.
7. Thêm 750 µl dung dịch AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút, giữ cột, bỏ nƣớc dƣới. Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 13000 vòng/phút trong 1 phút.
8. Chuyển cột sang một ống Eppendorf mới. Thêm 60 µl dung dịch AVE, để ở nhiệt độ phịng trong 1 phút. Sau đó ly tâm 8000 vịng/phút trong 1 rồi bỏ cột, giữ nƣớc dƣới, dung dich ở dƣới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Kí hiệu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -70°C.
c. Cách tiến hành chạy RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ đƣợc hỗn hợp với các thành phần đƣợc trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) 2X Reaction Mix 12.5 Mẫu RNA 5 Primer Forwad 0.5 Primer Reverse 0.5 Enzyme Taq 0.5
Nƣớc khử ion (DEPC – treated) 6
Tổng thể tích 25
Cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng này phát hiện đoạn gen S của virus PED.
Tên mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ Kích thƣớc
Mồi xi PS1 TTCTGAGTCACGAACAGCCA 651bp Mồi ngƣợc PS2 CATATGCAGCCTGCTCTGAA
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bƣớc tổng hợp Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1
Duỗi mạch 95 2 phút
2 Duỗi mạch 95 30 giây 35
Gắn mồi 55 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 60 giây
3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
d. Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả
Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel đƣợc chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 100°C trong 5 phút, để nguội 45-50°C bổ sung
03µl Ethidium bromide (nồng độ 10µg/10µl). Sau đó đổ vào khn có các lƣợc đƣợc cài sẵn để tạo bản gel. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ đung dịch đệm TBE ngập bản gel.
Bƣớc 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thƣờng sử dụng từ 4-6 µl DNA marker.
Bƣớc 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cƣờng độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bƣớc 4: Đọc kết quả
Sau khi điện di, vị trí các đoạn DNA đƣợc phát hiện bằng máy phát tia UV. Sau đó chụp ảnh và lƣu kết quả.
- Mẫu dƣơng tính với virus khi giếng chứa mẫu điện di xuất hiện vạch DNA tƣơng ứng với độ dài đoạn gen nhân lên.
- Mẫu âm tính khi khơng xuất hiện vạch DNA tƣơng ứng với độ dài đoạn gen khuếch đại.