Thống kê bệnh tích tế bào sau các thời gian gây nhiễm virus, xử lý số liệu và vẽ biểu đồ biểu diễn sự nhân lên của virus bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2003.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐẶC TÍNH SINH HỌC
4.1.1. Xác định các mẫu lợn Yorkshire dương tính với virus PEDV
Các mẫu bệnh phẩm đƣợc gửi về Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y khoa thú ý có biểu hiện lâm sàng nghi mắc bệnh, tại đây sẽ tiến hành xử lý mẫu rồi tiến hành chẩn đoán virus học bệnh PEDV. Các mẫu gửi đến chủ yếu bao gồm nguyên con, phủ tạng, phân và máu. Mẫu nguyên con và phủ tạng (gồm hạch, lách, phổi, ruột, tim, thận,…) đƣợc chọn lọc ƣu tiên lấy ruột và phân.
Sau khi nhận mẫu, tiến hành nghiền mẫu để phá vỡ tổ chức giải phóng virus PEDV (với mẫu là phủ tạng), hoặc ly tâm chắt huyết thanh (với mẫu là máu). Các mẫu đều đƣợc dùng bộ QUIAGEN Mini KIT để tách lấy RNA. RNA bệnh phẩm sau khi thu đƣợc sẽ đƣợc chạy PCR để giám định sự có mặt của virus PEDV trong bệnh phẩm hay không.
Sản phẩm sau khi khuếch đại đƣợc điện di và chụp ảnh. Kết quả của phản ứng RT- PCR xác định PEDV đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và hình ảnh 4.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cho thấy tất cả 15 con đƣợc chọn làm thí nghiệm đều cho kết quả dƣơng tính với PEDV. Sản phẩm điện di cho vạch DNA tƣơng ứng 651bp đúng theo thiết kế mồi.
Hình ảnh kiểm tra sản phẩm RT-PCR sau khi thực hiện với 2 mồi trên.
Hình 4.1. Gen đƣợc khuếch đại một phần gen S (651bp)
Mồi xuôi PS1: 5’-TTCTGACACGAACACAGCCA-3’
651b p
Mồi ngƣợc PS2: 5’-CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3’
Thang chuẩn M: 100bp (Giếng 1: Mẫu phân lợn 1, Giếng 2: Mẫu ruột lợn 1, Giếng 3: Mẫu phân lợn 2, Giếng 4: Đối chứng âm (nƣớc deion), Giếng 5: Đối chứng dƣơng (chủng virus PEDV vaccine)
Bảng 4.1. Kết quả của phản ứng RT-PCR ở các mẫu bệnh phẩm chẩn đoán bệnh PEDV
STT Nhóm lợn Số lƣợng Cơ quan Ruột Phân Dƣơn g tính Tỷ lệ (%) Âm tính Tỷ lệ (%) Dƣơn g tính Tỷ lệ (%) Âm tính Tỷ lệ (%) 1 Hà Nội 5 5 100 0 0 5 100 0 0 2 Hƣng Yên 3 3 100 0 0 3 100 0 0 3 Bắc Ninh 5 5 100 0 0 5 100 0 0 4 Vĩnh Phúc 2 2 100 0 0 2 100 0 0
So với thang chuẩn DNA (100bp ladder) thì giếng đối chứng dƣơng (+) cho vạch DNA tƣơng ứng 651bp (theo thiết kế mồi, giếng đối chứng âm, đối chứng dƣơng đều cho kết quả đúng nhƣ dự kiến đối chứng âm không cho vạch hay sản phẩm PCR-DNA, đối chứng dƣơng cho vạch. Các đối chứng dƣơng và đối chứng âm trong thí nghiệm đều cho kết quả nhƣ vậy do đó kết quả phản ứng là đáng tin cậy.
Các mẫu bệnh phẩm lấy để chẩn đoán PEDV là các mẫu ruột, phân lấy từ mẫu lợn con theo mẹ mắc tiêu chảy để khẳng định sự có mặt của PEDV, điều này chứng tỏ PEDV tồn tại chủ yếu trên đƣờng tiêu hóa của lợn con theo mẹ, kết quả này phù hợp với các triệu chứng lâm sàng, tổn thƣơng bệnh tích đại thể của lợn mắc PEDV. Kết quả phản ứng RT-PCR cho thấy, 15 lợn đƣợc chọn để tiến hành thí nghiệm đều dƣơng tính với PEDV đạt tỷ lệ 100%, kết quả này cao hơn kết quả các nghiên cứu của tác giả Nguyễn Tất Toàn. Tỷ lệ PEDV dƣơng tính của các mẫu ruột 58,14% cao hơn nhiều so với mẫu phân 16,96% (Nguyễn Tất Toàn và cs, 2012), tỷ lệ phân lập PEDV đƣợc tác giả nghiên cứu chủ yếu trên đƣờng tiêu hóa, phù hợp với nghiên cứu này. Nghiên cứu của tác giả Ishikawa and et all cũng chỉ ra rằng phƣơng pháp RT-PCR là phƣơng pháp xác định chính xác sự có mặt của
virus PEDV từ các mẫu lợn bị tiêu chảy thu đƣợc ở các trang trại chăn nuôi, bị tiêu chảy, RNA của PEDV đƣợc phát hiện đƣợc 4 mẫu dƣơng tính trong 11 mẫu ruột.
Kỹ thuật RT-PCR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này đã đƣợc chứng minh kiểm tra dễ dàng, nhanh chóng, chính xác để phát hiện các virus từ mẫu bệnh phẩm, cung cấp một phƣơng pháp thực tiễn cho việc chẩn đoán nhanh chóng nguyên nhân gây bệnh, một công cụ hữu ích và thiết thực cho việc phát hiện nhiễm virus trong mẫu bệnh phẩm.
4.1.2. Kết quả phân lập và giám định virus PEDV trên môi trƣờng tế bào
4.1.2.1. Kết quả phân lập virus PEDV
Trên các mẫu bệnh phẩm có kết quả RT-PCR dƣơng tính, tiến hành chọn lọc 15 mẫu phân và 15 mẫu ruột để chuẩn bị cho phân lập virus trên môi trƣờng tế bào Vero. Các mẫu cũ đƣợc lấy từ dịch nghiền của phân và dịch ruột đã đƣợc lƣu trong tủ - 80°C, chờ dã đông tự nhiên, ly tâm 1500 vòng /phút trong vòng 5 phút, sau đó thu lớp dịch phía trên chứa virus. Tiến hành lọc huyễn dịch bên trên bằng màng lọc Fillter có kích thƣớc lỗ lọc 0,45µm.
Phân lập virus PEDV đƣợc thực hiện trên tế bào Vero (ATCC CCL-81) nhƣ đã mô tả trƣớc đây với những sửa đổi. Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy và duy trì trong môi trƣờng thiết yếu tối thiểu (DMEM) có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò, 2 mM l-glutamine, 0,05 mg / ml gentamicin, 10 UI/ ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin, và 0,25 mg / ml amphotericin. Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy trong 6 đĩa đƣợc rửa sạch hai lần môi trƣờng sau khi cấy và cấy 300 ml mẫu và 100 ml môi trƣờng sau nuôi cấy. Môi trƣờng sau khi cấy là DMEM có bổ sung dung môi tryptose phosphate (0,3%), dịch chiết men (0,02%), và trypsin 250 (10 mg/ml). Sau 2 giờ ủ ở 37°C với 5% CO2, sau khi cấy 3,6 ml môi trƣờng đƣợc thêm vào mỗi giếng. Việc gây nhiễm tƣơng tự đƣợc thực hiện trên tế bào Vero trong tấm 96 giếng (gây nhiễm 100µl mỗi giếng) có thể giám định bệnh tích tế bào bằng kỹ thuật RT-PCR. Các tế bào đƣợc gây nhiễm ủ ở 37°C với 5% CO2. Khi 90% hiệu ứng bệnh lý tế bào (CPE) phát triển, các chủng virus sẽ đƣợc đông lạnh và rã đông một lần. Các hỗn hợp đƣợc ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4°C. Phần dịch nổi đƣợc thu để gây nhiễm thêm hoặc bảo quản ở -80°C.
Theo dõi đặc điểm bệnh tích tế bào (Cytopathic – CPE) gây ra do virus trong môi trƣờng tế bào Vero ngày một lần, trong vòng 7 lần liên tiếp sau khi gây nhiễm. Chỉ tiến hành theo dõi trong vòng 7 ngày vì sau 7 ngày nếu không thấy bất kỳ bệnh tích nào thì có thể coi mẫu bệnh phẩm đó âm tính (tức là không có
virus phát triển) vì đây là mốc thời gian dài nhất cho virus PEDV (nếu có) thích nghi và phát triển trên môi trƣờng Vero, các chủng virus này sẽ đƣợc đông lạnh và dã đông một lần và phần dịch nổi đƣợc thu để gây nhiễm vào tế bào Vero mới cho đời phân lập thứ hai. Các tế bào đƣợc gây nhiễm sẽ đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp RT-PCR nhƣ mô tả dƣới đây. Nếu CPE và RT-PCR đều âm tính sau 4 đời cấy truyền, kết quả phân lập virus đã đƣợc coi là âm tính.
Tiến hành phân lập virus PEDV từ 15 mẫu phân PEDV-PCR dƣơng tính và 15 mẫu ruột PEDV-PCR dƣơng tính trên tế bào Vero. Bốn mẫu PEDV phân lập đƣợc tại Hà Nội, Hƣng Yên, Bắc Ninh và Vĩnh Phúc đã thu đƣợc thành công từ ruột non của lợn con từ các trang trại lợn tƣơng ứng. Mọi nỗ lực để phân lập virus từ các mẫu còn lại đều không thành công. Khả năng gây độc tế bào đã đƣợc quan sát thấy trong các tế bào đƣợc cấy với một số mẫu ruột và rất nhiều mẫu phân nhƣng bệnh tích tế bào không rõ ràng. Kết quả phân lập virus PEDV đƣợc trình bày ở bảng 4.2, 4.3.
Bảng 4.2. Nguồn gốc của các mẫu lợn Yorkshire theo từng địa phƣơng đƣợc chẩn đoán dƣơng tính với PEDV
STT Địa phƣơng Số lƣợng Ghi chú
1 Hà Nội 5 Lợn con theo mẹ
2 Hƣng Yên 3 Lợn con theo mẹ
3 Bắc Ninh 5 Lợn sau cai sữa
4 Vĩnh Phúc 2 Lợn con theo mẹ
Tổng 15 Lợn con theo mẹ
Bảng 4.3. Kết quả phân lập virus PEDV trên môi trƣờng tế bào Vero
STT Địa phƣơng Số lƣợng Số lƣợng chủng phân lập đƣợc
1 Hà Nội 5 1
2 Hƣng Yên 3 1
3 Bắc Ninh 5 1
4 Vĩnh Phúc 2 1
Tổng 15 4
Quan sát bệnh tích tế bào do virus PEDV gây ra trên tế bào Vero. Bệnh tích tế bào CPE đặc trƣng bởi sự thay đổi hình thái tế bào, hình thành thể hợp bào, các tế bào bị phá vỡ màng tế bào, nhân tế bào co cụm lại và cuối cùng tế bào bị phá vỡ
hoàn toàn. Để xác định virus đƣợc phân lập có thể đƣợc sao chép hiệu quả và duy trì trong nuôi cấy tế bào hay không, bốn virus phân lập đƣợc tiếp tục truyền nối tiếp đời qua các tế bào Vero. Kết quả tiếp đời tế bào cho thấy CPE nổi bật thƣờng đƣợc quan sát thấy trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm trong quá trình nhân giống và bệnh tích tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 72 giờ gây nhiễm. Ví dụ về hình ảnh các CPE đƣợc hiển thị trong hình so với các tế bào Vero đối chứng âm, các tế bào Vero nhiễm virus PEDV (Hình4.2, 4.3, 4.4, 4.5) phân lập cho thấy các tế bào phì đại, dung hợp tế bào rõ ràng và hình thành hợp bào. Tốc độ tăng trƣởng của virus đã đƣợc xác nhận bởi phƣơng pháp Real time-PCR giám định lại sự phát triển, nhân lên của virus.
MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH TẾ BÀO DO VIRUS PED GÂY RA TRÊN TẾ BÀO VERO
Hình 4.2. Tế bào Vero bình thường Hình 4.3. Tế bào Vero khi bắt đầu
có bệnh tích Hình 4.4. Bệnh tích tế bào đang phát triển Hình 4.5. Tế bào bị phá hủy hoàn toàn
4.1.2.2. Kết quả giám định virus phân lập được bằng phương pháp RT-PCR
Sau khi tiến hành phân lập và thu hoạch virus thì tiến hành giám định bằng phƣơng pháp RT-PCR, để giám định lại sự phát triển và nhân lên của virus, sự biến đổi của tế bào Vero quan sát đƣợc có phải do virus PEDV hay do nguyên nhân khác do sai sót trong khâu chuẩn bị (môi trƣờng, tế bào, mẫu), tạp nhiễm…
Tất các 15 mẫu đem phân lập trên môi trƣờng tế bào Vero qua 3 đời đầu đều không gây bệnh tích cho tế bào Vero, đến đời thứ 4 mới gây bệnh tích tế bào
Để làm rõ kết quả trên, tiến hành chạy phản ứng RT-PCR từ dịch nuôi cấy của các mẫu virus PEDV đem phân lập. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả giám định virus PEDV trong các mẫu phân lập đời thứ 4
STT Địa phƣơng Số lƣợng Dƣơng tính Tỷ lệ (%)
1 Hà Nội 1 1 100
2 Hƣng Yên 1 1 100
3 Bắc Ninh 1 1 100
4 Vĩnh Phúc 1 1 100
Kết quá bảng 4.4 đã khẳng định bệnh tích tế bào có đƣợc là bệnh tích gây ra bởi virus PEDV có trong các mẫu bệnh phẩm và phƣơng pháp phân lập virus PEDV bằng tế bào Vero là hoàn toàn thích hợp.
4.1.3. Xác định hiệu giá của chủng virus phân lập đƣợc
Sau khi phân lập đƣợc 4 chủng virus PEDV dùng để nghiên cứu, tiếp tục tiến hành tìm hiểu đặc tính sinh học của chúng qua việc xác định hiệu giá virus. Tiến hành chuẩn bị một khay 96 giếng đã phủ tế bào Vero một lớp (tế bào phủ kín thành một lớp trên bề mặt nuôi cấy, không chồng chéo lên nhau). Số lƣợng tế bào trong một giếng của khay đƣợc xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình (phƣơng pháp đƣợc trình bày ở phần 3.5.6). Huyễn dịch virus đƣợc pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp của các giếng theo thứ tự đánh dấu trƣớc (25 µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, bổ sung vào mỗi giếng 100 µl dung dịch duy trì DMEM có chứa 10% TBP. Để khay tế bào đã gây nhiễm virus trong tủ ấm 37°C/5% CO2.
Quan sát CPE sau 5 ngày gây nhiễm qua các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60 giờ…. Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV khi quan sát tế bào sau khi gây nhiễm tại các thời điểm bằng kính hiển vi soi nổi. Mức độ CPE đƣợc tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích có bệnh tích tế bào so với tổng diện tích tế bào trong bình. CPE đạt 100% khi bệnh tích xuất hiện trên cả bề mặt tế bào nuôi cấy một lớp, 0% khi chƣa có bệnh tích tế bào. Từ đó xác định tƣơng đối mức độ bệnh tích. Chẳng hạn, CPE đạt 25% khi quan sát trong toàn bộ môi trƣờng nuôi cấy, bệnh tích tế bào xuất hiện trên ¼ diện tích.
Sau đó virus đƣợc thu hoạch và xác định TCID50 theo phƣơng pháp Reed- Muench. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả xác định hiệu giá virus của các chủng virus PEDV phân lập đƣợc
STT Chủng virus TCID50/25µl
1 PEDV-01 104.48
2 PEDV-02 104.25
3 PEDV-03 105.50
4 PEDV-04 104.74
Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy hiệu giá virus thấp nhất đƣợc xác định là chủng virus PEDV-02 với giá trị 104.25 TCID50/25µl, hiệu giá cao nhất đƣợc xác định là chủng virus PEDV-03 với giá trị 105.50TCID50/25µl. Các chủng virus PEDV có hiệu giá tƣơng đối cao, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trƣờng tế bào Vero sẽ đƣợc lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu các đặc tính sinh học sâu hơn.
4.1.4. Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV
Tiến hành nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng virus PEDV phân lập đƣợc qua việc đánh giá khả năng nhân lên của virus trên môi trƣờng tế bào Vero.
Để đánh giá một cách khách quan đặc tính sinh trƣởng, phát triển của virus, đầu tiên các huyễn dịch chứa virus đƣợc đem hiệu giá để tính toán giá trị TCID50. Sau đó mới đem gây nhiễm lên môi trƣờng tế bào Vero ở cùng một tỷ lệ MOI=0,1.
Tiến hành chuẩn bị một khay 96 giếng tế bào Vero đã mọc đều kín một lớp trên bề mặt nuôi cấy. Số lƣợng tế bào trong một giếng của khay đƣợc xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình. Sau đó, huyễn dịch chứa virus đƣợc đƣa vào gây nhiễm cho các giếng tế bào theo lƣợng thích hợp để đảm bảo MOI=0,1. Khay tế bào gây nhiễm virus đƣợc ủ ở 37°C/5% CO2 để theo dõi CPE qua các thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ,… sau gây nhiễm cho đến khi CPE không còn phát triển thêm trên các giếng tế bào nữa.
Kết quả theo dõi sự nhân lên của các chủng virus phân lập đƣợc qua sự phát triển bệnh tích tế bào trên môi trƣờng tế bào Vero đƣợc thể hiện ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Bệnh tích tế bào khi gây nhiễm các chủng virus PEDV phân lập
Mẫu PEDV-01 PEDV-02 PEDV-03 PEDV-04
CPE theo thời gian sau
khi gây nhiễm virus 24h - - + - 36h + + + + 48h ++ ++ ++ ++ 60h ++ ++ ++ ++ 72h ++ ++ +++ ++ 84h +++ +++ B +++ 96h B B B Ghi chú:
PEDV-01, PEDV-02, PEDV-3, PEDV-04: kí hiệu các chủng virus phân lập đƣợc
Không có bệnh tích -
5-10% tế bào có bệnh tích +
20-70% tế bào có bệnh tích ++
80-100% tế bào có bệnh tích +++
Toàn bộ tế bào bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy B
Phân tích bảng 4.6 cho thấy mẫu virus nghiên cứu đƣợc phân lập từ các lợn khác nhau có khả năng phát triển, nhân lên tƣơng đối giống nhau về qua trình xâm nhập và nhân lên trên môi trƣờng tế bào Vero. Các tế bào bị nhiễm virus PEDV co cụm lại với nhau chồi lên khỏi đáy bình nuôi cấy và khi tế bào bị virus
phá hủy hoàn toàn thì bong khỏi đáy bình, có thể quan sát ró hình thái bệnh tích này qua kính hiển vi soi ngƣợc. Bệnh tích tế bào bắt đầu xuất hiện sau 24 giờ gây nhiễm là sớm nhất với chủng PEDV-03 (hình 4.6), số lƣợng tế bào phá hủy tăng