Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1.2. Kết quả phân lập và giám định virus PEDV trên môi trƣờng tế bào
4.1.2.1. Kết quả phân lập virus PEDV
Trên các mẫu bệnh phẩm có kết quả RT-PCR dƣơng tính, tiến hành chọn lọc 15 mẫu phân và 15 mẫu ruột để chuẩn bị cho phân lập virus trên môi trƣờng tế bào Vero. Các mẫu cũ đƣợc lấy từ dịch nghiền của phân và dịch ruột đã đƣợc lƣu trong tủ - 80°C, chờ dã đông tự nhiên, ly tâm 1500 vịng /phút trong vịng 5 phút, sau đó thu lớp dịch phía trên chứa virus. Tiến hành lọc huyễn dịch bên trên bằng màng lọc Fillter có kích thƣớc lỗ lọc 0,45µm.
Phân lập virus PEDV đƣợc thực hiện trên tế bào Vero (ATCC CCL-81) nhƣ đã mô tả trƣớc đây với những sửa đổi. Tế bào Vero đƣợc ni cấy và duy trì trong mơi trƣờng thiết yếu tối thiểu (DMEM) có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò, 2 mM l-glutamine, 0,05 mg / ml gentamicin, 10 UI/ ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin, và 0,25 mg / ml amphotericin. Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy trong 6 đĩa đƣợc rửa sạch hai lần môi trƣờng sau khi cấy và cấy 300 ml mẫu và 100 ml môi trƣờng sau nuôi cấy. Môi trƣờng sau khi cấy là DMEM có bổ sung dung mơi tryptose phosphate (0,3%), dịch chiết men (0,02%), và trypsin 250 (10 mg/ml). Sau 2 giờ ủ ở 37°C với 5% CO2, sau khi cấy 3,6 ml môi trƣờng đƣợc thêm vào mỗi giếng. Việc gây nhiễm tƣơng tự đƣợc thực hiện trên tế bào Vero trong tấm 96 giếng (gây nhiễm 100µl mỗi giếng) có thể giám định bệnh tích tế bào bằng kỹ thuật RT-PCR. Các tế bào đƣợc gây nhiễm ủ ở 37°C với 5% CO2. Khi 90% hiệu ứng bệnh lý tế bào (CPE) phát triển, các chủng virus sẽ đƣợc đông lạnh và rã đông một lần. Các hỗn hợp đƣợc ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4°C. Phần dịch nổi đƣợc thu để gây nhiễm thêm hoặc bảo quản ở -80°C.
Theo dõi đặc điểm bệnh tích tế bào (Cytopathic – CPE) gây ra do virus trong mơi trƣờng tế bào Vero ngày một lần, trong vịng 7 lần liên tiếp sau khi gây nhiễm. Chỉ tiến hành theo dõi trong vịng 7 ngày vì sau 7 ngày nếu không thấy bất kỳ bệnh tích nào thì có thể coi mẫu bệnh phẩm đó âm tính (tức là khơng có
virus phát triển) vì đây là mốc thời gian dài nhất cho virus PEDV (nếu có) thích nghi và phát triển trên mơi trƣờng Vero, các chủng virus này sẽ đƣợc đông lạnh và dã đông một lần và phần dịch nổi đƣợc thu để gây nhiễm vào tế bào Vero mới cho đời phân lập thứ hai. Các tế bào đƣợc gây nhiễm sẽ đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp RT-PCR nhƣ mô tả dƣới đây. Nếu CPE và RT-PCR đều âm tính sau 4 đời cấy truyền, kết quả phân lập virus đã đƣợc coi là âm tính.
Tiến hành phân lập virus PEDV từ 15 mẫu phân PEDV-PCR dƣơng tính và 15 mẫu ruột PEDV-PCR dƣơng tính trên tế bào Vero. Bốn mẫu PEDV phân lập đƣợc tại Hà Nội, Hƣng Yên, Bắc Ninh và Vĩnh Phúc đã thu đƣợc thành công từ ruột non của lợn con từ các trang trại lợn tƣơng ứng. Mọi nỗ lực để phân lập virus từ các mẫu cịn lại đều khơng thành cơng. Khả năng gây độc tế bào đã đƣợc quan sát thấy trong các tế bào đƣợc cấy với một số mẫu ruột và rất nhiều mẫu phân nhƣng bệnh tích tế bào khơng rõ ràng. Kết quả phân lập virus PEDV đƣợc trình bày ở bảng 4.2, 4.3.
Bảng 4.2. Nguồn gốc của các mẫu lợn Yorkshire theo từng địa phƣơng đƣợc chẩn đốn dƣơng tính với PEDV
STT Địa phƣơng Số lƣợng Ghi chú
1 Hà Nội 5 Lợn con theo mẹ
2 Hƣng Yên 3 Lợn con theo mẹ
3 Bắc Ninh 5 Lợn sau cai sữa
4 Vĩnh Phúc 2 Lợn con theo mẹ
Tổng 15 Lợn con theo mẹ
Bảng 4.3. Kết quả phân lập virus PEDV trên môi trƣờng tế bào Vero
STT Địa phƣơng Số lƣợng Số lƣợng chủng phân lập đƣợc
1 Hà Nội 5 1
2 Hƣng Yên 3 1
3 Bắc Ninh 5 1
4 Vĩnh Phúc 2 1
Tổng 15 4
Quan sát bệnh tích tế bào do virus PEDV gây ra trên tế bào Vero. Bệnh tích tế bào CPE đặc trƣng bởi sự thay đổi hình thái tế bào, hình thành thể hợp bào, các tế bào bị phá vỡ màng tế bào, nhân tế bào co cụm lại và cuối cùng tế bào bị phá vỡ
hoàn toàn. Để xác định virus đƣợc phân lập có thể đƣợc sao chép hiệu quả và duy trì trong ni cấy tế bào hay không, bốn virus phân lập đƣợc tiếp tục truyền nối tiếp đời qua các tế bào Vero. Kết quả tiếp đời tế bào cho thấy CPE nổi bật thƣờng đƣợc quan sát thấy trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm trong quá trình nhân giống và bệnh tích tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 72 giờ gây nhiễm. Ví dụ về hình ảnh các CPE đƣợc hiển thị trong hình so với các tế bào Vero đối chứng âm, các tế bào Vero nhiễm virus PEDV (Hình4.2, 4.3, 4.4, 4.5) phân lập cho thấy các tế bào phì đại, dung hợp tế bào rõ ràng và hình thành hợp bào. Tốc độ tăng trƣởng của virus đã đƣợc xác nhận bởi phƣơng pháp Real time-PCR giám định lại sự phát triển, nhân lên của virus.
MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH TẾ BÀO DO VIRUS PED GÂY RA TRÊN TẾ BÀO VERO
Hình 4.2. Tế bào Vero bình thường Hình 4.3. Tế bào Vero khi bắt đầu
có bệnh tích Hình 4.4. Bệnh tích tế bào đang phát triển Hình 4.5. Tế bào bị phá hủy hồn toàn
4.1.2.2. Kết quả giám định virus phân lập được bằng phương pháp RT-PCR
Sau khi tiến hành phân lập và thu hoạch virus thì tiến hành giám định bằng phƣơng pháp RT-PCR, để giám định lại sự phát triển và nhân lên của virus, sự biến đổi của tế bào Vero quan sát đƣợc có phải do virus PEDV hay do nguyên nhân khác do sai sót trong khâu chuẩn bị (mơi trƣờng, tế bào, mẫu), tạp nhiễm…
Tất các 15 mẫu đem phân lập trên môi trƣờng tế bào Vero qua 3 đời đầu đều khơng gây bệnh tích cho tế bào Vero, đến đời thứ 4 mới gây bệnh tích tế bào
Để làm rõ kết quả trên, tiến hành chạy phản ứng RT-PCR từ dịch nuôi cấy của các mẫu virus PEDV đem phân lập. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả giám định virus PEDV trong các mẫu phân lập đời thứ 4
STT Địa phƣơng Số lƣợng Dƣơng tính Tỷ lệ (%)
1 Hà Nội 1 1 100
2 Hƣng Yên 1 1 100
3 Bắc Ninh 1 1 100
4 Vĩnh Phúc 1 1 100
Kết quá bảng 4.4 đã khẳng định bệnh tích tế bào có đƣợc là bệnh tích gây ra bởi virus PEDV có trong các mẫu bệnh phẩm và phƣơng pháp phân lập virus PEDV bằng tế bào Vero là hồn tồn thích hợp.