Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.5.9. Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin theo Robert (1969) and Burn (1974). Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể đƣợc thực hiện theo quy trình tẩm đúc bằng paraffin, nhuộm Hematoxilin – Eosin (HE). Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Các bƣớc của quá trình làm tiêu bản vi thể nhƣ sau:
Khử formol
+ Mục đích để rửa sạch formol.
+ Sau khi cố định bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7-10 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có kích thƣớc 4 – 5mm, cho vào các cassette, ghi tên bệnh phẩm. Sau đó, các cassette đƣợc rửa nƣớc chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
+ Đƣa mẫu và hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động.
Bảng 3.1 Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian
1 Cồn 60° 1 :00 2 Cồn 60° 1 :00 3 Cồn 70° 1 :30 4 Cồn 80° 1 :30 5 Cồn 96° 1 :30 6 Cồn 100° 1 :30 7 Cồn 100° 1 :30 8 Cồn 100° 1 :30 9 Xylen 1 :30 10 Xylen 1 :30 11 Paraffin 2 :00 12 Paraffin 2 :00
Đúc tiêu bản
Đúc mẫu bệnh phẩm trong paraffin.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Cắt mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với độ dày 2-3µm. Dán mảnh: Miếng tổ chức sau khi cắt sẽ đƣợc dàn phẳng trên phiến kính nhờ cho vào bình nƣớc ấm 50°C. Sau đó để tủ ấm 37°C trong 12 – 24h đến khi bệnh phẩm khơ là có thể đem nhuộm đƣợc.
Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản theo phƣơng pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxilin- Eosin. Các bƣớc nhuộm nhƣ sau:
+ Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm 3 lọ:
Xylen I : 10 phút
Xylen II : 10 phút
Xylen III : 10 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 100° : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 95° : 1 lần
Cồn 70° : 1 lần
Cồn 50° : 1 lần
Khử cồn: Cho dƣới vòi nƣớc chảy 15 phút. + Nhuộm Hematoxinlin (nhuộm nhân):
Sau khi đã rửa tiêu bản qua nƣớc chảy trong vịng 15 phút ta đem lau khơ nƣớc xung quanh tiêu bản, đặt tiêu bản lên trên giá để rồi nhỏ Hematoxinlin ngập tiêu bản, để trong vịng 5 phút. Sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa nƣớc chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxinlin thừa. Đem lau sạch nƣớc xung quanh tiêu bản và vẩy khô. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tím là đƣợc. Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu đậm quá thì dừng nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 60° + HCl, tỷ lệ là 1%) trong 30 giây.
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản 5-10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nƣớc chảy 10 phút cho hết Eosin thừa. Sau khi rửa nƣớc ta lau sạch phần nƣớc xung quanh bệnh phẩm rồi vào quy trình tẩy nƣớc.
+ Tẩy nƣớc: Ta cho tiên bản qua hệ thống Cồn 90° I : 15 giây Cồn 100° I : 15 giây Cồn 100° II : 15 giây
+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua Xylen I. Rồi sang Xylen II, ta lau sạch cồn ở xung quanh lam kính rồi chuyển sang Xylen III rồi sang Xylen IV, sau đó cho vào Xylen đã làm nóng trong tủ tủ ấm 37°C trong vòng 2 phút.
Gắn Baume Canada
Nhỏ một giọt Baume Canada, Xylen ấm lên trên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen ấm lên trên tiêu bản. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngồi.
Đánh giá kết quả
Đem soi kính hiển vi quang học với vật kính 10X. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tƣơng bắt màu đỏ tƣơi, tiêu bản trong sáng, khơng có nƣớc, khơng có bọt khí là đƣợc.