3.5.1. Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng
Phƣơng pháp quan sát triệu chứng lâm sàng của lợn Yorkshire nghi mắc PEDV ngay từ khi lợn Yorkshire xuất hiện những dấu hiệu đầu tiên. Đồng thời kết hợp giữa đặc điểm dịch tễ địa phƣơng với việc thu thập thông tin từ chủ gia súc và cán bộ thú y để tăng độ tin cậy chẩn đoán.
Quan sát biến đổi đại thể thông qua việc mổ khám những lợn Yorkshire có triệu chứng lâm sàng của PEDV.
3.5.2. Phƣơng pháp mổ khám
Để xác định đƣợc các biến đổi đại thể của các cơ quan ở lợn Yorkshire nghi mắc PEDV cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng đặc trƣng của bệnh. Quá trình mổ khám tuân theo quy trình mổ khám TCVN-TC16-2005.
3.5.3. Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
Các mẫu đƣợc lấy theo quy định của ngành: Mẫu cơ quan, tổ chức cần lấy đúng (lấy đứng cơ quan, đúng vùng tổn thƣơng điển hình); lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lƣợng cần thiết).
3.5.4. Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT- PCR
a. Chuẩn bị mẫu cho phản ứng RT-PCR
Lấy bệnh phẩm từ tủ âm sâu để cho tan đá.
Nghiền bệnh phẩm: cắt nhỏ bệnh phẩm cho vào Eppendorf 1,5ml nghiền nát bệnh phẩm với môi trƣờng DMEM thành huyễn dịch đồng nhất. Sau đó đem ly tâm bỏ phần cặn. Phần dung dịch thu đƣợc bảo quản ở -80°C cho đến khi sử dụng.
Lƣu ý: Tất cả các thao tác đƣợc tiến hành trong buồng cấy vô trùng các hóa chất đƣợc sử dụng đều vô trùng, các dụng cụ đƣợc sử dụng đều phải đƣợc hấp vô trùng trƣớc và sau khi sử dụng.
b. Tách chiết RNA virus bằng KIT QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất Kit. 1. Hút 560 µl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
2. Thêm 140 µl dung dịch mẫu đã xử lý là hỗn dịch (chứa virut và dung dịch PBS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau đó lắc đều nhanh trong 15 giây rồi để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
3. Thêm 560 µl dung dich Ethanol (96-100°), lắc đều nhanh trong 15 giây. 4. Chuyển 630 µl huyễn dịch trên sang cột QIAamp spin. Ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ nƣớc dƣới.
5. Lặp lại bƣớc 4.
6. Thêm 750 µl dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút rồi giữ cột, bỏ nƣớc dƣới.
7. Thêm 750 µl dung dịch AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút, giữ cột, bỏ nƣớc dƣới. Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 13000 vòng/phút trong 1 phút.
8. Chuyển cột sang một ống Eppendorf mới. Thêm 60 µl dung dịch AVE, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 rồi bỏ cột, giữ nƣớc dƣới, dung dich ở dƣới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Kí hiệu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -70°C.
c. Cách tiến hành chạy RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ đƣợc hỗn hợp với các thành phần đƣợc trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) 2X Reaction Mix 12.5 Mẫu RNA 5 Primer Forwad 0.5 Primer Reverse 0.5 Enzyme Taq 0.5
Nƣớc khử ion (DEPC – treated) 6
Tổng thể tích 25
Cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng này phát hiện đoạn gen S của virus PED.
Tên mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ Kích thƣớc
Mồi xuôi PS1 TTCTGAGTCACGAACAGCCA 651bp Mồi ngƣợc PS2 CATATGCAGCCTGCTCTGAA
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bƣớc tổng hợp Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1
Duỗi mạch 95 2 phút
2 Duỗi mạch 95 30 giây 35
Gắn mồi 55 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 60 giây
3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
d. Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả
Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel đƣợc chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 100°C trong 5 phút, để nguội 45-50°C bổ sung
03µl Ethidium bromide (nồng độ 10µg/10µl). Sau đó đổ vào khuôn có các lƣợc đƣợc cài sẵn để tạo bản gel. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ đung dịch đệm TBE ngập bản gel.
Bƣớc 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thƣờng sử dụng từ 4-6 µl DNA marker.
Bƣớc 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cƣờng độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bƣớc 4: Đọc kết quả
Sau khi điện di, vị trí các đoạn DNA đƣợc phát hiện bằng máy phát tia UV. Sau đó chụp ảnh và lƣu kết quả.
- Mẫu dƣơng tính với virus khi giếng chứa mẫu điện di xuất hiện vạch DNA tƣơng ứng với độ dài đoạn gen nhân lên.
- Mẫu âm tính khi không xuất hiện vạch DNA tƣơng ứng với độ dài đoạn gen khuếch đại.
3.5.5. Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân lập virus
Mẫu bệnh phẩm đƣợc nghiền nát bằng chày và cối vô trùng, sau đó đồng nhất trong dung dịch DMEM. Ly tâm tốc độ cao rồi thu lại hỗn dịch, sau đó hỗn dịch đƣợc lọc qua màng lọc thu đƣợc hỗn dịch đồng nhất để gây nhiễm vào tế bào Vero.
3.5.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào
Để chuẩn bị các bƣớc nghiên cứu tiếp theo, cần phải chuẩn bị lƣợng tế bào Vero cần thiết.
a. “Gọi” tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng DMEM bổ sung 5% FBS làm ấm trong tủ 37°C trong 30 phút, trƣớc khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bƣớc 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bƣớc 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bƣớc 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM bổ sung 5% FBS, chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trƣờng DMEM bổ sung 5% FBS.
Bƣớc 4: Giữ tế bào ở tủ ấm 37°C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới.
b. Cấy chuyển tế bào
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lƣợng tế bào lên một lƣợng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bƣớc 1: Loại bỏ môi trƣờng đang nuôi dƣỡng, rửa tế bào bằng dung dịch PBS (không chứa Ca2+ hoặc Mg2+).
Bƣớc 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trysin-EDTA.Thêm 7ml môi trƣờng không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bƣớc 3: Loại bỏ Trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bƣớc 4: Cân bằng môi trƣờng và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi trƣờng đầy đủ. Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990 µl môi trƣờng không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
Bƣớc 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào 2.105
tế bào/ml trong môi trƣờng đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi cấy mới (6 ml/bình T25, 15 ml/bình T75).
Bƣớc 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37°C, 5% CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
c. Thu tế bào
Sau khi có đủ số lƣợng tế bào cần thiết, tế bào đƣợc thu và bảo quản để tiếp tục sử dụng những lần khác. Mỗi tế bào thƣờng có một giới hạn nhất định về số lần nuôi cấy, thực chất là số lần phân chia tế bào, trừ tế bào ung thƣ có khả năng phân chia vô hạn. Vì thế, trong các lần cấy chuyển và thu hoạch cần ghi hồ sơ theo dõi tế bào để đảm bảo chất lƣợng tế bào cho nghiên cứu.
Các bƣớc thu tế bào giống với các bƣớc cấy chuyển tế bào, chỉ khác ở bƣớc 5 và bƣớc 6.
Bƣớc 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5.106 tế bào/ml trong môi trƣờng đầy đủ có bổ sung DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1ml/ống.
Bƣớc 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20°C trong 2-3 giờ, chuyển sang -80°C qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nito lỏng.
3.5.7. Phƣơng pháp phân lập virus trên môi trƣờng tế bào
a. Chuẩn bị tế bào phân lập
Tế bào Vero đƣợc đƣa vào nuôi cấy trong môi trƣờng và điều kiện thích hợp, môi trƣờng DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum) làm ấm trong tủ 37°C trong 30 phút trƣớc khi lấy tế bào mọc vừa kín đáy đĩa lồng thì tiến hành gây nhiễm virus.
b. Chuẩn bị mẫu
Mẫu bệnh phẩm đƣợc nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau đó đƣợc đồng nhất trong dung dịch DMEM. Ly tâm tốc độ cao thu lại hỗn dịch. Hỗn dịch đồng nhất qua lọc đƣợc lấy để gây nhiễm vào tế bào Vero.
c. Gây nhiễm virus và quan sát sự phát triển của virus
Từ các đĩa lồng đã có tế bào Vero chuẩn bị ở trƣớc đó hút bỏ môi trƣờng nuôi cấy và hút 100µl mẫu phân lập rồi ủ ở 37°C trong 30 phút sau đó bổ sung 1,5 ml môi trƣờng phân lập gồm (DMEM có chứa 10% TPB (Tryptose Phosphate Broth), 10µg/ml Trypsin, 0,02% Yearst extract) vào đĩa lồng và để ở 37°C với 5% CO2. Hàng ngày theo dõi sự phá huỷ tế bào của virus bằng kính hiển vi soi nổi, thay 80% thể tích môi trƣờng phân lập hàng ngày và thu lại virus khi tế bào bị phá hủy đạt 80% - 90% diện tích đáy của đĩa lồng. Nếu không thấy xuất hiện bệnh tích thì thu lại virus sau 7 ngày gây nhiễm và gây nhiễm lại lần nữa để kiểm tra bệnh tích.
3.5.8. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50
Tế bào Vero một lớp đƣợc chuẩn bị trên khay 96 giếng. Mỗi giếng chứa 2,0.104 tế bào, dịch môi trƣờng đƣợc hút bỏ. Huyễn dịch chứa bệnh phẩm đƣợc ly tâm bỏ cặn, lấy phần nƣớc trong pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp các giếng theo thứ tự đánh dấu trƣớc (25 µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 5% FBS đƣợc bổ sung vào các giếng tế bào đã gây nhiễm virus (100 µl/giếng).
Bệnh tích tế bào (CPE-Cyto Pathogenic Effect) đƣợc quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm. TCID50 đƣợc xác định theo phƣơng pháp Reed-Muench (Nguyễn Thị Lan và cs., 2005).
3.5.9. Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin theo Robert (1969) and Burn (1974). Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể đƣợc thực hiện theo quy trình tẩm đúc bằng paraffin, nhuộm Hematoxilin – Eosin (HE). Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Các bƣớc của quá trình làm tiêu bản vi thể nhƣ sau:
Khử formol
+ Mục đích để rửa sạch formol.
+ Sau khi cố định bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7-10 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có kích thƣớc 4 – 5mm, cho vào các cassette, ghi tên bệnh phẩm. Sau đó, các cassette đƣợc rửa nƣớc chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
+ Đƣa mẫu và hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động.
Bảng 3.1 Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian
1 Cồn 60° 1 :00 2 Cồn 60° 1 :00 3 Cồn 70° 1 :30 4 Cồn 80° 1 :30 5 Cồn 96° 1 :30 6 Cồn 100° 1 :30 7 Cồn 100° 1 :30 8 Cồn 100° 1 :30 9 Xylen 1 :30 10 Xylen 1 :30 11 Paraffin 2 :00 12 Paraffin 2 :00
Đúc tiêu bản
Đúc mẫu bệnh phẩm trong paraffin.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Cắt mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với độ dày 2-3µm. Dán mảnh: Miếng tổ chức sau khi cắt sẽ đƣợc dàn phẳng trên phiến kính nhờ cho vào bình nƣớc ấm 50°C. Sau đó để tủ ấm 37°C trong 12 – 24h đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm đƣợc.
Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản theo phƣơng pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxilin- Eosin. Các bƣớc nhuộm nhƣ sau:
+ Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm 3 lọ:
Xylen I : 10 phút
Xylen II : 10 phút
Xylen III : 10 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 100° : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 95° : 1 lần
Cồn 70° : 1 lần
Cồn 50° : 1 lần
Khử cồn: Cho dƣới vòi nƣớc chảy 15 phút. + Nhuộm Hematoxinlin (nhuộm nhân):
Sau khi đã rửa tiêu bản qua nƣớc chảy trong vòng 15 phút ta đem lau khô nƣớc xung quanh tiêu bản, đặt tiêu bản lên trên giá để rồi nhỏ Hematoxinlin ngập tiêu bản, để trong vòng 5 phút. Sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa nƣớc chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxinlin thừa. Đem lau sạch nƣớc xung quanh tiêu bản và vẩy khô. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tím là đƣợc. Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu đậm quá thì dừng nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 60° + HCl, tỷ lệ là 1%) trong 30 giây.
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản 5-10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nƣớc chảy 10 phút cho hết Eosin thừa. Sau khi rửa nƣớc ta lau sạch phần nƣớc xung quanh bệnh phẩm rồi vào quy trình tẩy nƣớc.
+ Tẩy nƣớc: Ta cho tiên bản qua hệ thống Cồn 90° I : 15 giây Cồn 100° I : 15 giây Cồn 100° II : 15 giây
+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua Xylen I. Rồi sang Xylen II, ta lau sạch cồn ở xung quanh lam kính rồi chuyển sang Xylen III rồi sang Xylen IV, sau đó cho vào Xylen đã làm nóng trong tủ tủ ấm 37°C trong vòng 2 phút.
Gắn Baume Canada
Nhỏ một giọt Baume Canada, Xylen ấm lên trên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen ấm lên trên tiêu bản. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
Đánh giá kết quả
Đem soi kính hiển vi quang học với vật kính 10X. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tƣơng bắt màu đỏ tƣơi, tiêu bản trong sáng, không có nƣớc, không có bọt khí là đƣợc.
3.5.10. Phƣơng pháp thống kê, xử lý số liệu
Thống kê bệnh tích tế bào sau các thời gian gây nhiễm virus, xử lý số liệu và vẽ biểu đồ biểu diễn sự nhân lên của virus bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2003.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐẶC TÍNH SINH HỌC
4.1.1. Xác định các mẫu lợn Yorkshire dương tính với virus PEDV
Các mẫu bệnh phẩm đƣợc gửi về Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y khoa thú ý có biểu hiện lâm sàng nghi mắc bệnh, tại đây sẽ tiến hành xử lý mẫu rồi tiến hành chẩn đoán virus học bệnh PEDV. Các mẫu gửi đến chủ yếu bao gồm nguyên con, phủ tạng, phân và máu. Mẫu nguyên con và phủ tạng (gồm hạch, lách, phổi, ruột, tim, thận,…) đƣợc chọn lọc ƣu tiên lấy ruột và phân.
Sau khi nhận mẫu, tiến hành nghiền mẫu để phá vỡ tổ chức giải phóng virus PEDV (với mẫu là phủ tạng), hoặc ly tâm chắt huyết thanh (với mẫu là máu). Các mẫu đều đƣợc dùng bộ QUIAGEN Mini KIT để tách lấy RNA. RNA bệnh phẩm sau khi thu đƣợc sẽ đƣợc chạy PCR để giám định sự có mặt của virus PEDV trong bệnh phẩm hay không.
Sản phẩm sau khi khuếch đại đƣợc điện di và chụp ảnh. Kết quả của phản ứng RT- PCR xác định PEDV đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và hình ảnh 4.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cho thấy tất cả 15 con đƣợc chọn làm thí nghiệm đều cho kết quả dƣơng tính với PEDV. Sản phẩm điện di cho vạch DNA tƣơng