Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.3. Một số vi khuẩn thường gặp tron gô nhiễm thịt động vật
2.3.3. Vi khuẩn Salmonella
Salmonella là vi khuẩn có mặt ở đường tiêu hoá của nhiều loài động vật
như lợn, trâu, bò, cừu, gia cầm, thậm chí ở cả động vật lưỡng cư. Salmonella
thường xâm nhập gây ô nhiễm thực phẩm. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của người ngộ độc thực phẩm do Salmonella là đau bụng, đi ngoài, nôn mửa, sốt,
giảm ăn. Trẻ em cịn có thể bị mất nước nghiêm trọng và suy kiệt nhanh. Thời kỳ ủ bệnh khác nhau từ vài giớ đến 3 ngày, nhưng thường từ 12-36h.
2.3.3.1. Đặc tính sinh học và hình thái
Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae.
Giống Salmonella gồm 2 loài: S. enterica và S. bongori đã được phân chia
thành trên 3000 serotyp theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và đôi khi các kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K). Trong đó phân lồi S. enterica subsp. gồm phần lớn các chủng Salmonella là những tác nhân gây bệnh cho người và động vật
(Letellier et al., 2009).
Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001), vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn ngắn, hai đầu trịn, có kích thước 0,4-0,6 x 1,0-3,0 µm, bắt màu Gram âm, khơng hình thành nha bào và giáp mơ. Đa số lồi Salmonella có lơng (flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S. gallinarum-pullorum). Lông giúp cho vi
khuẩn có khả năng di động. Lơng có hình trịn, dài, xuất phát từ màng cytoplasma. Do có cấu trúc từ các sợi protein hình xoắn nên có thể co giãn và di
động nên lơng của chúng rất khó nhuộm. Nếu nhuộm bằng phương pháp Haschem thì có thể nhìn thấy chúng dưới kính hiển vi điện tử. Lơng có tính kháng ngun và do các gen mã hóa tổng hợp protein riêng quy định. Ngoài ra, trên bề mặt màng ngồi của vi khuẩn Salmonella đều có các cấu trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili.
Theo Takeshi et al. (2009), Fimbriae tạo cho vi khuẩn khả năng bám dính
(adhesion) lên các tế bào biểu mô ruột và xâm nhập vào lớp niêm mạc.
2.3.3.2. Tính chất ni cấy
Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí khơng bắt buộc, dễ nuôi
cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC, nhưng có thể phát triển được ở nhiệt độ từ 6- 42oC. Nuôi cấy ở 43oC có thể loại trừ được tạp khuẩn mà Salmonella vẫn phát triển được (Phạm Song và Nguyễn Hữu Quỳnh, 2008). pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,6 tuy nhiên, vi khuẩn vẫn phát triển được ở pH từ 6-9. Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường BPW (Buffered Pepton Water) và môi trường RV (Rappaport Vassiliadi), sau vài giờ nuôi cấy thấy môi trường vẩn đục nhẹ, sau 18 đến 24 giờ thấy canh trùng đục đều, trên mặt môi trường có màng mỏng, đáy ống nghiệm có cặn.
Hiện nay có rất nhiều loại mơi trường chọn lọc được các nhà vi sinh vật thú y sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phân lập vi khuẩn Salmonella như: Môi trường thạch DHL (Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose agar) sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trịn, lồi, bóng láng (dạng S), có màu vàng nhạt. Môi trường thạch MacConkey vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc trịn lồi, trong khơng màu, nhẵn bóng. Trên mơi trường thạch CHROMTM Salmonella, sau 24 giờ ni cấy, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, trịn, bóng láng (dạng S) và có màu tím hồng. Trong mơi trường thạch TSI (Triple Sugar Iron), vi khuẩn Salmonella do sản sinh alkaline nên phần thạch
nghiêng có màu đỏ (pH=7,3), đáy ống nghiệm màu vàng (pH=6,8) do vi khuẩn chỉ lên men đường glucose. Phần giữa ống nghiệm có màu đen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S. Nếu để lâu (quá 24 giờ), màu đen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần đáy ống nghiệm (khơng nhìn thấy màu vàng). Trong môi trường LIM (Lysine Indole Motility), vi khuẩn không làm chuyển màu môi trường, mơi trường có màu tím nhạt. Mơi trường Malonate, vi khuẩn không phát triển nên không làm thay đổi màu môi trường. Môi trường thạch thường sau 24
giờ ni cấy, hình thành những khuẩn lạc lớn, hình thái rất khác nhau, trung bình đường kính từ 2- 3mm. Khuẩn lạc có thể trịn, mặt hơi lồi, rìa bề mặt và rìa hình khía răng cưa. Một số serotyp đơi khi hình thành các khuẩn lạc dạng nhầy như:
S.paratyphi B. Trên môi trường thạch Endo vi khuẩn Salmonella hình thành khuẩn lạc màu trắng hồng, trịn trơn, nhẵn bóng trơng như những hạt sương long lanh trên màu hồng nhạt của mơi trường. Trên mơi trường thạch Brilliant green
Salmonella hình thành khuẩn lạc màu trắng hồng, sáng, bao bọc xung quanh bởi
môi trường màu đỏ sáng. Trên môi trường thạch XLD khuẩn lạc màu đen bóng, hơi lồi.
2.3.3.3. Đặc tính sinh hố
Theo Van et al., (2012), giống vi khuẩn Salmonella được chia thành 7 phân nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại đường nhất định và không đổi. Phần lớn phân loài S. enterica subsp. enterica gây bệnh cho động vật máu nóng. Chúng lên men và sinh hơi: glucoza, mannit, mantoza, galactoza, dulcitol, arabonoza, sorbitol. Cũng ở nhóm này, hầu như các chủng vi khuẩn Salmonella
đều không lên men lactoza và saccaroza. Đa số các vi khuẩn thuộc giống
Salmonella không làm tan chảy gelatin, không phân giải urê, không sản sinh Indol
(Trừ Salmonella Cholera suis). Phản ứng MR, catalaza dương). Phản ứng oxidaza âm tính. Phản ứng sinh H2S dương tính (trừ S. paratyphi A, S. Typhisuis).
2.3.3.4. Sức đề kháng của vi khuẩn Salmonella
Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt độ và các chất sát trùng mạnh. Ở
nhiệt độ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 100oC trong 15 phút hoặc ánh sáng mặt trời chiếu thẳng trong 5 giờ có thể diệt được vi khuẩn (Bahnson et al., 2006). Các chất sát trùng thông thường dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như phenol 5%, formon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15- 20 phút.
Theo Bahnson et al., (2006), vi khuẩn Salmonella sống được lâu trong điều kiện lạnh, chúng có thể sống trong bột thịt 8 tháng, nhưng ở điều kiện mơi trường có độ pH ≤ 5 chúng chỉ sống được trong thời gian ngắn. Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong chất độn chuồng tới trên 30 tuần, có thể sống ở trong đất với độ sâu 0,5m trong thời gian 2 tháng. Ở sàn gỗ, tường gỗ trong điều kiện ít ánh sáng là 87 ngày, máng gỗ 108 ngày.
Nguyễn Như Thanh và cs (2001), cho biết trong nước tù đọng, đồng cỏ ẩm thấp S. typhimurium có thể tồn tại trên 7 tháng. Trong xác súc vật chết,
Salmonella có thể sống trên 100 ngày, trong thịt ướp muối từ 6-8 tháng.
2.3.3.5. Khả năng gây bệnh của Salmonella
Có những Salmonella chỉ gây bệnh cho người (như S.typhi, S.paratyphi A,
B, C). Có loại vừa gây bệnh cho người vừa gây bệnh cho động vật (như các loại
Salmonella gây nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn). Có loại chỉ gây bệnh cho động
vật (như S. typhi suis). Vi khuẩn Salmonella theo thức ăn và nước uống xâm nhập vào đường tiêu hóa gây nên biểu hiện toàn thân: sốt li bì, nhịp tim giảm, huyết áp giảm, đây là dấu hiệu đặc trưng của bệnh thương hàn. Nhiễm độc thức ăn do Salmonella gây viêm dạ dầy - ruột thường gặp hơn và tỷ lệ mắc lớn hơn nhiều so với bệnh thương hàn. Ở các nước công nghiệp nguyên nhân gây chứng viêm dạ dày- ruột chủ yếu là do Campylobacter và Salmonella spp.
Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2011), vi khuẩn Salmonella gây ngộ độc thực
phẩm chủ yếu do hai loại vi khuẩn S.enteritidis và S. typhimurium. Quá trình gây ngộ độc thực phẩm diễn ra cần có hai điều kiện: Thức ăn phải nhiễm số lượng lớn vi khuẩn sống (vì tính chất gây ngộ độc của vi khuẩn yếu) và vi khuẩn vào cơ thể sản sinh một số lượng lớn độc tố. Nguồn truyền nhiễm thường là do thịt bị ô nhiễm Salmonella, nhưng cũng có thể là do trứng vịt, trứng ngỗng, trứng gà bị nhiễm vi khuẩn. Vi khuẩn Salmonella bị nhiễm vào cơ thể với số lượng khoảng 102- 103 vi khuẩn thì các triệu chứng cấp tính sẽ xuất hiện: nơn, ỉa chảy đột ngột kèm theo sốt cao. Các dấu hiệu lâm sàng là do nội độc tố gây ra. Bệnh thường khỏi sau 2 - 4 ngày, khi khỏi, người lành bệnh thường không mang vi khuẩn, rất hiếm trường hợp bị nhiễm trùng huyết và mung mủ cục bộ.
2.3.3.6. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella
Chỉ với một lượng rất nhỏ vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm cũng có
thể gây lên những vụ ngộ độc thực phẩm cấp tính. Chính vì vậy, u cầu vệ sinh thực phẩm đối với vi khuẩn Salmonella đặt ra rất nghiêm ngặt.
Salmonella là vi khuẩn có mặt ở đường tiêu hố của nhiều lồi động vật
như lợn, trâu, bò, cừu, gia cầm, thậm chí ở cả động vật lưỡng cư. Ngoài thiên nhiên vi khuẩn Salmonella tồn tại trong đất, nước thải, phân rác...
a. Các yếu tố không phải là độc tố * Kháng nguyên O
độc lực của vi khuẩn Salmonella. Cụ thể là: S. typhimurium nếu thay đổi thành phần kháng nguyên từ công thức 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì vi khuẩn từ dạng có độc lực chuyển sang dạng khơng có độc lực (Wegener et al., 2003).
Kháng nguyên O là yếu tố độc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào. Kháng nguyên O khích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng. Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn. Đến nay, người ta đã xác định được trên 3000 serotyp kháng nguyên O của Salmonella, thành phần kháng nguyên của vi khuẩn S. choleraesuis gồm: O6, O7; S. typhimurium gồm: O1, O4, O5, O12; S. enteritidis gồm: O1, O9, O12.
* Kháng nguyên H
Kháng ngun H khơng có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phịng bệnh, cũng không quyết định yếu tố độc lực, tuy vậy nó có vai trị bảo vệ cho vi khuẩn khơng bị tiêu diệt bởi q trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong các tế bào đại thực bào, cũng như trong tế bào gan và thận (Takeshi et al., 2009).
* Kháng nguyên K
Bản chất hóa học của kháng nguyên K là polysaccharid nhưng thực chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O. Kháng nguyên K tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001)
* Yếu tố bám dính
Theo Kishima et al., (2008), khả năng bám dính của vi khuẩn Salmonella
lên tế bào nhung mao ruột là bước khởi đầu quan trọng trong quá trình gây bệnh. Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất lý hóa, vừa mang tính chất sinh học.
* Yếu tố xâm nhập
Theo Cortez et al., (2006), khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc lớp niêm mạc của đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella có độc lực.
Các biến chủng Salmonella khơng có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là
các chủng khơng có độc lực.
lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa Actin Dipolimeriring Enzim, làm thay đổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến đổi màng tế bào, dẫn đến hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn. Sau đó vi khuẩn Salmonella xâm nhập được vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với số lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh độc tố đường ruột (enterotoxin) và gây tiêu chảy cho vật chủ (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2011).
* Khả năng tổng hợp sắt
Theo Van et al., (2012), khả năng tổng hợp sắt là một yếu tố giúp vi khuẩn
Salmonella tăng nhanh về số lượng, làm suy yếu khả năng chống đỡ của vật chủ
do bị thiếu sắt.
* Khả năng kháng kháng sinh
Khi vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh, khả năng kháng kháng sinh là một trong các yếu tố quan trọng giúp cho vi khuẩn kháng lại các yếu tố bất lợi của môi trường xung quanh. Hầu hết các chủng Salmonella có khả năng kháng
lại một hoặc nhiều loại kháng sinh.
b. Các yếu tố là độc tố
Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là độc tố là những tác nhân gián tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các yếu tố gây bệnh là độc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết định quá trình sinh bệnh. Các yếu tố gây bệnh là độc tố của Salmonella bao gồm: nội độc tố (endotoxin), ngoại độc tố đường ruột (enterotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin).
* Độc tố đường ruột (Enterotoxin)
Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: độc tố thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và độc tố thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor).
+ Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (heat-stabile toxin: ST). Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp
Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, và thực hiện khả năng thẩm
xuất sau 1- 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). ST có khả năng chịu được nhiệt độ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở -20oC. Cấu trúc phân tử gồm nhiều polysaccharide và một số chuỗi polypeptide. Độc tố thẩm xuất nhanh (RPE) kích
thích lên hệ thống men guanylate cyclase trong tế bào biểu mô ruột, chuyển GTP thành GDP. Trong tế bào, GDP tăng cao làm cho nồng độ ion Ca++ cũng tăng cao, dẫn đến ngăn cản hấp thu chất điện giải và nước ở trong xoang ruột. Do vậy, lượng nước trong ruột tăng cao, kích thích niêm mạc ruột, tăng co bóp, làm gia súc ỉa chảy.
+ Yếu tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (LT), và thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18- 24 giờ, có thể kéo dài 36- 48 giờ. Độc tố thẩm xuất chậm (DPF) bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ. Cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptid và một số hợp chất khác. Phân tử lượng 40.000- 50.000 dalton. Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mơ bào vào lịng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thối hóa lớp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy.
Phạm Song và Nguyễn Hữu Quỳnh (2008), kết luận, 81,81% số chủng S. typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh độc tố không chịu nhiệt
(LT) có khả năng gây tích nước trong ruột non của lợn thí nghiệm.
* Nội độc tố (endotoxin)
Nội độc tố nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn và được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharid (LPS). LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với các đặc tính và chức năng riêng biệt: vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A. Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharid chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharid, ở trung tâm, nối kháng nguyên O với vùng lipit A. Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi khuẩn. Cấu trúc nội độc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của
Salmonella. Các đột biến gen ở vùng lõi, vùng ưa nước làm cho Salmonella
khơng cịn độc lực. Nội độc tố là LPS được tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện độc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: tế bào lâm ba cầu B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách.
* Độc tố tế bào (cytotoxin)
bào có nhân và làm trương tế bào CHO. Đa phần độc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt độ.
Theo Wegener et al., (2003), làm tổn thương tế bào biểu mơ là đặc tính
quan trọng của cytotoxin. Có ít nhất là 3 dạng cytotoxin:
+ Dạng 1: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin. Độc tố này có trọng lượng phân tử khoảng 56- 78 kDa, nó tác động theo cơ chế là ức chế tổng