Tác nhân block Nồng độ OD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ± STD BSA 1% 1,007 0,942 0,93 0,960 ± 0,041 b 3% 0,41 0,402 0,388 0,400 ± 0,011 c 5% 0,279 0,264 0,272 0,272 ± 0,008 d Sữa tách bơ 1% 0,150 0,173 0,154 0,159 ± 0,012 e 3% 0,124 0,122 0,129 0,125 ± 0,003 e 5% 0,099 0,095 0,097 0,097 ± 0,001 e Gelatin 1% 0,187 0,149 0,152 0,163 ± 0,002 a 3% 0,101 0,102 0,099 0,101 ± 0,012 a
(Theo hàng dọc những số mang chữ cái khác nhau có ý nghĩa thống kê)
Giá trị OD thấp nhất đạt được ở nồng độ sữa tách bơ 5% và gelat in 3%. Tuy nhiên, xét về mức độ ổn định của giá trị OD giữa các lần thí nghiệm với các nồng độ khác nhau thì sữa tách bơ thể hiện khả năng hạn chế hiện tượng dương tính giả tốt hơn gelatin. Sự khác biệt về OD giữa ba nồng độ này với các nồng độ còn lại có ý nghĩa thống kê nhưng sự khác biệt giữa chúng thì không có
ý nghĩa thống kê. Vì vậy, chúng tôi chọn sữa tách bơ 5% làm tác nhân block giếng cho quy trình ELISA.
3.5.3 Kết quả xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu của T.
evansi và anti-bovine IgG:HRPO
Với nồng độ kháng nguyên RoTAT1.2 là 30 µg/ml, ủ đĩa qua đêm ở 4oC. Độ pha loãng huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu của T. evansi là 1:400, phản ứng kháng nguyên-kháng thể được thực hiện ở 370C trong 45, 60, 90, 120 phút. Giá trị OD450 của phản ứng được đo 3 lần cho thấy: tất cả các tỷ lệ S/N tại các thời gian phản ứng đều nằm trong khoảng 3,6-3,8, trong đó giá trị này cao nhất đạt tại thời điểm 90 phút phản ứng. Đây chính là thời gian thích hợp để ủ kháng thể với kháng nguyên.
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian ủ huyết thanh đến kết quả phản ứng ELISA
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện ủ phức hợp phản ứng kháng nguyên-kháng thể và anti-bovine IgG:HRPO được thực hiện trong 30, 45, 60, 90 phút ở nhiệt độ phòng, giá trị OD450 cũng được xác định 3 lần, giá trị S/N của các mẫu phản ứng cũng nằm trong khoảng từ 3,6 đến 3,8 (hình 3.14), trong đó tỷ lệ S/N tại 45 phút là cao nhất, đây chính là thời gian thích hợp để ủ anti-bovine IgG:HRPO với phức hợp kháng thể- kháng nguyên.
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian ủ anti-bovine IgG:HRPO đến kết quả phản ứng ELISA
3.6. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng ELISA
Đánh giá hiệu quả chẩn đoán của một phương pháp huyết thanh học thì các giá trị độ nhạy và độ đặc hiệu phải được thực hiện trên gia súc gây nhiễm và không gây nhiễm với mầm bệnh. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, số lượng gia súc thí nghiệm không nhiều (3 con trâu gây nhiễm T. evansi và 07 con trâu không gây nhiễm) vì vậy có thể gây sai số khi tính các giá trị này. Để chính xác hơn trong việc xác định độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2 để xác định bệnh T. evansi trên trâu ở Việt Nam, chúng tôi sử dụng 52 mẫu huyết thanh trâu thí nghiệm, trong đó có: 18 mẫu dương tính với T. evansi đã được kiểm tra bằng phương pháp tiêm truyền chuột và ELISA với kháng nguyên hòa tan của T. evansi (bao gồm 03 mẫu trâu gây nhiễm với T. evansi), 34 mẫu âm tính với T. evansi (bao gồm 07 mẫu trâu không gây nhiễm T. evansi, đã được điều trị Berenil và kiểm tra huyết thanh âm tính với T. evansi trong 1 tháng) được sử dụng để thiết lập phản ứng ELISA chẩn đoán bệnh T. evansi bằng kháng nguyên RoTAT 1.2. Kết quả phản ứng ELISA được thể hiện ở bảng 3.7.