Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho sự tổng hợp

3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.3.5. Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho sự tổng hợp

3.3.5. Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2

Những chủng mang gen mã hóa cho chất kháng kháng sinh Amp thì có khả năng sống sót trong môi trường có Amp. Ở đây, chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 mang vector tái tổ hợp (được gắn một đoạn gen kháng Amp) có khả năng sống trên môi trường có Amp. Tuy nhiên nồng độ chất kháng sinh có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của chủng biểu hiện nên việc chọn nồng độ chất kháng sinh thích hợp là điều rất cần thiết. Chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 được nuôi cấy 3 giờ trong 3 bình tam giác ở điều kiện pH 7, 370C, ở nồng độ Amp trong môi trường (100 g/ml, 150 g/ml và 200 g/ml). Mức độ tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE (hình 3.9).

Hình 3.9. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ kháng sinh ampicillin bổ sung vào môi trƣờng

M: thang protein chuẩn, 1-3: protein thu được từ dịch tăng sinh chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 ở các nồng độ amp là 100 g/ml, 150 g/ml và 200 g/ml

Kết quả điện di trên hình 3.9 cho thấy, cả ba mẫu dịch tăng sinh đều có chưa thành phần protein có trọng lượng là 8 kDa, hình ảnh vạch điện di thành phần protein này có kích thước tương tự nhau có nghĩa là trong môi trường có nồng độ Amp là 100 g/ml, 150 g/ml và 200 g/ml thì khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp của chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 là như nhau. Như vậy, để thu được kháng nguyên RoTAT 1.2, nồng độ Amp là 100 g/ml là thích hợp để biểu hiện kháng nguyên từ chủng vi khuẩn này.

3.3.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của IPTG đến sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2

IPTG (isopropyl -D-thiogalactoside) là chất cảm ứng đối với T7 lac promoter. Promoter này điều khiển trực tiếp quá trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2. Vì vậy, IPTG đóng vai trò mấu chốt đến khả năng tổng hợp protein tái tổ hợp RoTAT 1.2. Để làm sáng tỏ sự ảnh hưởng của chất này đến kết quả tổng hợp kháng nguyên RoTAT 1.2, IPTG được bổ sung vào môi trường với các nồng độ từ 1 - 3 mM. Chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 được nuôi cấy ở các điều kiện pH 7, thời gian tăng sinh 3 giờ, nhiệt độ tăng sinh 370

C, nồng độ kháng sinh ampicillin là 100 g/ml, nồng độ IPTG cảm ứng là 1 mM, 2 mM và 3 mM. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong hình 3.10.

Hình 3.10. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ IPTG cảm ứng

M: thang protein chuẩn, 2-5: protein thu được từ dịch tăng sinh chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 được cảm ứng với các nồng độ IPTG là 3, 2, 1 mM

Kết quả hình 3.10 cho thấy, IPTG có ảnh hưởng rất lớn đến sự biểu hiện protein tái tổ hợp RoTAT 1.2, lượng protein tái tổ hợp tăng tỷ lệ với nồng độ IPTG. Ở nồng độ IPTG là 3 mM cho băng protein là đậm nhất hay lượng protein tái tổ hợp được tổng hợp nhiều nhất. Với mong muốn thu được lượng kháng nguyên tái tổ hợp nhiều nhất, thực tế, chúng tôi đã khảo sát mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 với nồng độ IPTG là 4-6 mM nhưng kết quả cho thấy rằng protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 cũng không được biểu hiện nhiều hơn. Do vậy, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 3 mM là thích hợp để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2.

3.4. Biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2

Sau khi đã lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp, chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 được nuôi cấy với các điều kiện: pH môi trường là 7; nồng độ Amp là 100 g/ml; nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, thời gian tăng sinh 3 giờ sau đó bổ sung IPTG với nồng độ 3 mM để cảm ứng trong 4 giờ, dịch nuôi cấy vi khuẩn được thu, kiểm tra, tinh sạch và kiểm tra khả năng được phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu với Trypanosoma

evansi. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong các hình 3.11, 3.12, 3.13.

Hình 3.11. Protein thu đƣợc từ dịch nuôi cấy chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2

1-7: protein thu được từ dịch nuôi cấy chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2, M: thang protein chuẩn

Kết quả hình 3.11 cho thấy băng protein ở kích thước 8 kDa xuất hiện rất đậm ở các đường chạy số 1-7 chứng tỏ chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 biểu hiện tốt ở các điều kiện nuôi cấy đã lựa chọn được. Tuy nhiên, hình ảnh điện di đồ cũng thấy rõ: protein tái tổ hợp sau khi biểu hiện thành công vẫn bị lẫn các protein khác. Để thu được protein tinh sạch, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Ni2+. Protein tái tổ hợp kháng RoTAT 1.2 có chứa 6 gốc histidine. Đây là đuôi Histag được mã hóa bởi các bộ 3 mã hóa nằm trên gen mã hóa kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên RoTAT 1.2 (hình 3.1). Đuôi Histag này có ái lực mạnh đối với Ni2+ nên khi chảy qua cột Ni2+ sẽ gắn kết tạm thời với Ni2+ trong khi các protein khác sẽ được rửa trôi. Protein tái tổ hợp gắn trong cột sắc ký Ni2+ được tách bởi native elution buffer (hình 3.12).

Hình 3.12. Điện di protein RoTAT 1.2 tinh sạch trên gel SDS-PAGE

M: Thang protein chuẩn, 1-5: kháng nguyên RoTAT 1.2 thu ở pha 1, 2, 3, 4 Kết quả điện di trên hình 3.12 cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh sạch đều chỉ xuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thước 8 kDa, trong đó, phân đoạn 2 thu được lượng protein nhiều nhất. Chứng tỏ rằng đã tinh sạch thành công protein RoTAT 1.2.

coli BL21- pET32/RoTAT1.2 đã được sử dụng để xác định tính kháng nguyên đặc hiệu của T. evansi. Tuy nhiên, trải qua quá trình tối ưu đều kiện nuôi cấy vi khuẩn và tinh sạch protein RoTAT 1.2, liệu rằng protein này còn được phát hiện đặc hiệu bởi kháng thể kháng T. evansi hay không. Kết quả phản ứng western blot trên hình 3.13 cho thấy protein này được nhận biết đặc hiệu bởi kháng thể kháng T. evansi, vạch phản ứng của protein RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu với T. evansi tương đương với vạch phản ứng của kháng nguyên hòa tan của T. evansi với kháng thể đặc hiệu. Kết quả này cho phép kết luận rằng, kháng nguyên RoTAT 1.2 đã được chế tạo thành công bằng công nghệ tái tổ hợp gen.

Hình 3.13. Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein RoTAT 1.2

M: Thang protein chuẩn, 1: kháng nguyên hòa tan của T. evansi với kháng thể đặc hiệu, 2: protein RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu của T. evansi

3.5. Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 xây dựng quy trình phản ứng ELISA phát hiện bệnh tiên mao trùng

Quy trình ELISA chúng tôi sử dụng là ELISA gián tiếp với các bước như sau:

1. Phủ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 2. Phủ sữa tách bơ

3. Gắn kháng thể đặc hiệu với T. evansi

4. Gắn kháng thể đặc hiệu loài có gắn enzyme (conjugate) 5. Cơ chất sinh màu

Sử dụng phương pháp checkerboard để xác định các thông số của quy trình bao gồm: nồng độ kháng nguyên, độ pha loãng kháng thể, thời gian phủ kháng nguyên, thời gian ủ kháng thể, thời gian ủ kháng thể đặc hiệu loài.

3.5.1 Kết quả xác định hàm lƣợng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA

Kháng nguyên RoTAT 1.2 được chế tạo bằng công nghệ tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi trong tế bào E. coli BL21, kháng nguyên này có thể được nhận biết đặc hiệu bởi kháng thể kháng T. evansi. Kháng nguyên RoTAT1.2 được pha loãng và phủ lên đĩa ELISA (Nunc, Mỹ) ở các nồng độ: 15; 20; 25; 30, 35 µg/ml.

Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu của T. evansi được pha loãng trong PBS theo các tỷ lệ 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600.

Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA trong bảng 3.1 cho thấy: giá trị S/N đạt cao nhất là 3,85, tương ứng với nồng độ kháng nguyên RoTAT1.2 là 30 µg/ml, độ pha loãng huyết thanh là 1:400. Đây là các nồng độ được coi là thích hợp nhất cho phản ứng ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu của T. evansi.

Bảng 3.1. Xác định hiệu giá huyết thanh và nồng độ kháng nguyên tối ƣu cho phản ứng ELISA (S/N)

Nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 (µg/ml)

Độ pha loãng huyết thanh dƣơng chuẩn

1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 15 3,30 3,46 3,08 2,67 2,85 20 3,30 3,43 2,19 2,62 2,57 25 3,21 3,64 3,33 2,78 2,72 30 3,33 3,31 3,85 2,81 3,36 35 2,27 3,43 2,44 2,85 2,58

3.5.2. Khảo sát tác nhân block giếng

Đối với các thử nghiệm miễn dịch lai trên pha rắn như ELISA thì khi tiến hành trên mẫu, các protein không phải là protein mục tiêu có thể gắn lên bề mặt giếng tại những vị trí không có kháng thể phủ giếng và làm giảm độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình. Tác nhân block giếng được sử dụng để hạn chế hiện tượng này.

Các tác nhân block thường sử dụng trong ELISA là các protein như BSA (bovine serum albumin), sữa gầy hoặc casein, gelatin. Trong thí nghiệm này, ba tác nhân block giếng là BSA, sữa tách bơ (skim milk) và gelatin được khảo sát để tìm ra tác nhân block cho tín hiệu nền thấp nhất cho quy trình ELISA, mỗi giá trị nồng độ của một tác nhân block được lặp lại 3 lần. Các giếng trong thí nghiệm này không bổ sung kháng nguyên RoTAT 1.2 mà bổ sung tác nhân block nhằm xem xét tín hiệu nền của phản ứng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Giá trị OD của phản ứng ELISA với các tác nhân block

Tác nhân block Nồng độ OD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ± STD BSA 1% 1,007 0,942 0,93 0,960 ± 0,041 b 3% 0,41 0,402 0,388 0,400 ± 0,011 c 5% 0,279 0,264 0,272 0,272 ± 0,008 d Sữa tách bơ 1% 0,150 0,173 0,154 0,159 ± 0,012 e 3% 0,124 0,122 0,129 0,125 ± 0,003 e 5% 0,099 0,095 0,097 0,097 ± 0,001 e Gelatin 1% 0,187 0,149 0,152 0,163 ± 0,002 a 3% 0,101 0,102 0,099 0,101 ± 0,012 a

(Theo hàng dọc những số mang chữ cái khác nhau có ý nghĩa thống kê)

Giá trị OD thấp nhất đạt được ở nồng độ sữa tách bơ 5% và gelat in 3%. Tuy nhiên, xét về mức độ ổn định của giá trị OD giữa các lần thí nghiệm với các nồng độ khác nhau thì sữa tách bơ thể hiện khả năng hạn chế hiện tượng dương tính giả tốt hơn gelatin. Sự khác biệt về OD giữa ba nồng độ này với các nồng độ còn lại có ý nghĩa thống kê nhưng sự khác biệt giữa chúng thì không có

ý nghĩa thống kê. Vì vậy, chúng tôi chọn sữa tách bơ 5% làm tác nhân block giếng cho quy trình ELISA.

3.5.3 Kết quả xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu của T.

evansi và anti-bovine IgG:HRPO

Với nồng độ kháng nguyên RoTAT1.2 là 30 µg/ml, ủ đĩa qua đêm ở 4oC. Độ pha loãng huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu của T. evansi là 1:400, phản ứng kháng nguyên-kháng thể được thực hiện ở 370C trong 45, 60, 90, 120 phút. Giá trị OD450 của phản ứng được đo 3 lần cho thấy: tất cả các tỷ lệ S/N tại các thời gian phản ứng đều nằm trong khoảng 3,6-3,8, trong đó giá trị này cao nhất đạt tại thời điểm 90 phút phản ứng. Đây chính là thời gian thích hợp để ủ kháng thể với kháng nguyên.

Hình 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian ủ huyết thanh đến kết quả phản ứng ELISA

Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện ủ phức hợp phản ứng kháng nguyên-kháng thể và anti-bovine IgG:HRPO được thực hiện trong 30, 45, 60, 90 phút ở nhiệt độ phòng, giá trị OD450 cũng được xác định 3 lần, giá trị S/N của các mẫu phản ứng cũng nằm trong khoảng từ 3,6 đến 3,8 (hình 3.14), trong đó tỷ lệ S/N tại 45 phút là cao nhất, đây chính là thời gian thích hợp để ủ anti-bovine IgG:HRPO với phức hợp kháng thể- kháng nguyên.

Hình 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian ủ anti-bovine IgG:HRPO đến kết quả phản ứng ELISA

3.6. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng ELISA

Đánh giá hiệu quả chẩn đoán của một phương pháp huyết thanh học thì các giá trị độ nhạy và độ đặc hiệu phải được thực hiện trên gia súc gây nhiễm và không gây nhiễm với mầm bệnh. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, số lượng gia súc thí nghiệm không nhiều (3 con trâu gây nhiễm T. evansi và 07 con trâu không gây nhiễm) vì vậy có thể gây sai số khi tính các giá trị này. Để chính xác hơn trong việc xác định độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2 để xác định bệnh T. evansi trên trâu ở Việt Nam, chúng tôi sử dụng 52 mẫu huyết thanh trâu thí nghiệm, trong đó có: 18 mẫu dương tính với T. evansi đã được kiểm tra bằng phương pháp tiêm truyền chuột và ELISA với kháng nguyên hòa tan của T. evansi (bao gồm 03 mẫu trâu gây nhiễm với T. evansi), 34 mẫu âm tính với T. evansi (bao gồm 07 mẫu trâu không gây nhiễm T. evansi, đã được điều trị Berenil và kiểm tra huyết thanh âm tính với T. evansi trong 1 tháng) được sử dụng để thiết lập phản ứng ELISA chẩn đoán bệnh T. evansi bằng kháng nguyên RoTAT 1.2. Kết quả phản ứng ELISA được thể hiện ở bảng 3.7.

Bảng 3.3. Kết quả phản ứng ELISA để xác định độ nhạy và đặc hiệu

Kết quả

Các mẫu huyết thanh trâu nhiễm T.

evansi

Các mẫu huyết thanh trâu không nhiễm T.

evansi Tổng số Xét nghiệm (+) 17 2 08 Xét nghiệm (-) 1 32 02 Tổng số 18 34 10

Từ 18 mẫu máu trâu dương tính với T. evansi có 17 mẫu dương tính với phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2, điều đáng chú ý là 03 mẫu máu trâu gây nhiễm với T. evansi phân lập được từ Lạng Sơn đều có kết quả dương tính. Tương tự như vậy, trong 32/34 mẫu máu trâu âm tính với T. evansi và phản ứng ELISA cũng bao gồm 07 mẫu máu trâu không gây nhiễm T. evansi. Kết quả trên cho phép phát hiện độ nhạy của phản ứng (Se) là 94,12%, độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) là 99,44%.

3.7. Xác định mức độ lặp lại của kết quả phản ứng

10 mẫu huyết thanh trâu được lấy ngẫu nhiên để thực hiện 5 lần phản ứng ELISA với kháng nguyên RoTAT1.2 ở các điều kiện như nhau. Kết quả phản ứng được đo tại bước sóng 450 nm.

Bảng 3.4. Kết quả xác định mức độ lặp lại kết quả phản ứng ELISA Mẫu

huyết thanh

Kết quả ELISA OD450 Giá trị trung bình CV(%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 1 0,203 0,199 0,186 0,217 0,217 0,204 6,41 2 0,075 0,072 0,069 0,071 0,068 0,071 3,86 3 0,217 0,217 0,198 0,203 0,199 0,207 4,59 4 0,181 0,192 0,187 0,184 0,194 0,187 2,89 5 0,096 0,111 0,099 0,125 0,118 0,109 11,22 6 0,091 0,094 0,092 0,087 0,084 0,09 4,51 7 0,068 0,063 0.0 0,061 0,069 0,064 0,065 5,22 8 0,195 0,201 0,198 0,197 0,199 0 ,198 1,13 9 0,468 0,453 0,487 0,467 0,417 0,458 5,70 10 0,071 0,075 0,068 0,069 0,072 0,071 3,86

Kết quả trong bảng 3.8 cho thấy, hệ số biến động (CV) cao nhất là 11,22%, hệ số này càng cao thì sự sai khác giữa các lần phản ứng càng lớn. Xác định sự sai khác giữa các lần lặp cho thấy, phản ứng ELISA để chẩn đoán bệnh T. evansi dựa vào kháng nguyên RoTAT1.2 cho kết quả hoàn toàn tương đương nhau giữa các lần thí nghiệm.

3.7.1. Đánh giá khả năng phát hiện của bệnh của phản ứng ELISA trên mẫu máu trâu, bò nghi nhiễm tiên mao trùng máu trâu, bò nghi nhiễm tiên mao trùng

Trong phản ứng ELISA, một mẫu huyết thanh được xem là có tương tác đặc hiệu nhấtvới một kháng nguyên khi giá trị OD của mẫu đó lớn hơn một giá trị ngưỡng (cut-off) đáng tin cậy. Thông thường, giá trị ngưỡng được tính dựa trên