thanh trâu nhiễm T.
evansi
Các mẫu huyết thanh trâu không nhiễm T.
evansi Tổng số Xét nghiệm (+) 17 2 08 Xét nghiệm (-) 1 32 02 Tổng số 18 34 10
Từ 18 mẫu máu trâu dương tính với T. evansi có 17 mẫu dương tính với phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2, điều đáng chú ý là 03 mẫu máu trâu gây nhiễm với T. evansi phân lập được từ Lạng Sơn đều có kết quả dương tính. Tương tự như vậy, trong 32/34 mẫu máu trâu âm tính với T. evansi và phản ứng ELISA cũng bao gồm 07 mẫu máu trâu không gây nhiễm T. evansi. Kết quả trên cho phép phát hiện độ nhạy của phản ứng (Se) là 94,12%, độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) là 99,44%.
3.7. Xác định mức độ lặp lại của kết quả phản ứng
10 mẫu huyết thanh trâu được lấy ngẫu nhiên để thực hiện 5 lần phản ứng ELISA với kháng nguyên RoTAT1.2 ở các điều kiện như nhau. Kết quả phản ứng được đo tại bước sóng 450 nm.
Bảng 3.4. Kết quả xác định mức độ lặp lại kết quả phản ứng ELISA Mẫu Mẫu
huyết thanh
Kết quả ELISA OD450 Giá trị trung bình CV(%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 1 0,203 0,199 0,186 0,217 0,217 0,204 6,41 2 0,075 0,072 0,069 0,071 0,068 0,071 3,86 3 0,217 0,217 0,198 0,203 0,199 0,207 4,59 4 0,181 0,192 0,187 0,184 0,194 0,187 2,89 5 0,096 0,111 0,099 0,125 0,118 0,109 11,22 6 0,091 0,094 0,092 0,087 0,084 0,09 4,51 7 0,068 0,063 0.0 0,061 0,069 0,064 0,065 5,22 8 0,195 0,201 0,198 0,197 0,199 0 ,198 1,13 9 0,468 0,453 0,487 0,467 0,417 0,458 5,70 10 0,071 0,075 0,068 0,069 0,072 0,071 3,86
Kết quả trong bảng 3.8 cho thấy, hệ số biến động (CV) cao nhất là 11,22%, hệ số này càng cao thì sự sai khác giữa các lần phản ứng càng lớn. Xác định sự sai khác giữa các lần lặp cho thấy, phản ứng ELISA để chẩn đoán bệnh T. evansi dựa vào kháng nguyên RoTAT1.2 cho kết quả hoàn toàn tương đương nhau giữa các lần thí nghiệm.
3.7.1. Đánh giá khả năng phát hiện của bệnh của phản ứng ELISA trên mẫu máu trâu, bò nghi nhiễm tiên mao trùng máu trâu, bò nghi nhiễm tiên mao trùng
Trong phản ứng ELISA, một mẫu huyết thanh được xem là có tương tác đặc hiệu nhấtvới một kháng nguyên khi giá trị OD của mẫu đó lớn hơn một giá trị ngưỡng (cut-off) đáng tin cậy. Thông thường, giá trị ngưỡng được tính dựa trên giá trị OD trung bình của một lượng lớn các mẫu âm tính với kháng nguyên mục tiêu. Số mẫu âm càng lớn thì giá trị ngưỡng càng đáng tin cậy.
Công thức xác định giá trị ngưỡng (cut off):
Cut off = OD trung bình của các mẫu âm + 2* STD lớn nhất của các mẫu âm
Số mẫu âm mà chúng tôi sử dụng dể tính giá trị ngưỡng là 15 mẫu. Giá trị ngưỡng tính được là 0,63.
Huyết thanh của trâu, bò nghi nhiễm bệnh tiên mao trùng được giữ trong tủ - 800C. 60 mẫu huyết thanh gồm 46 mẫu huyết thanh trâu và 14 mẫu huyết thanh bò được thu thập để phát hiện kháng thể đặc hiệu của T. evansi. Các mẫu máu của những con trâu,bò này được kiểm tra song song bằng phương pháp PCR để so sánh hiệu quả phát hiện. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.5. Kết quả xác định trâu, bò nhiễm bệnh tiên mao trùng bằng phƣơng pháp ELISA và PCR Kết quả phản ứng ELISA Kết quả phản ứng PCR Số mẫu dƣơng tính Số mẫu âm tính Tổng số Số mẫu dương tính 6 3 9 Số mẫu âm tính 2 49 51 Tổng số 8 52 60
Với 60 mẫu huyết thanh trâu, bò thu thập ngoài thực địa, phản ứng PCR đã phát hiện được 8 mẫu dương tính và 52 mẫu âm tính, tỷ lệ phát hiện dương tính đạt 13,3%; trong khi đó, phản ứng ELISA phát hiện được 9 mẫu dương tính và 51 mẫu âm tính, tỷ lệ phát hiện dược tính đạt 15%. So với phương pháp PCR, tỷ lệ trùng hợp ngẫu nhiên của các mẫu dương tính ELISA là: 6/(6+2) x 100%= 75% , tỷ lệ trùng hợp ngẫu nhiên của các mẫu âm tính ELISA là 49/(49+3) x 100%= 94%, tỷ lệ trùng hợp ngẫu nhiên tổng số là: (6+49)/60* 100%= 91,7%. Trong nghiên cứu này, độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ELISA đạt tới 94,12% và 99,44% và theo Holland, 2001[26]: độ nhạy của phản ứng PCR là 78,2%, độ đặc hiệu là 100%. Trong thực tế, ELISA là phương pháp phát hiện gián tiếp bệnh tiên mao trùng thông qua sự có mặt của kháng thể đặc hiệu với T. evansi trong khi đó PCR là phương pháp phát hiện trực tiếp sự có mặt của ký sinh trùng trong máu của vật chủ. Vì vậy, khi con vật mới mắc bệnh trong khoảng 1 tuần đầu, hàm lượng kháng thể tạo ra thấp có thể dẫn tới hiện tượng âm tính giả với phản ứng ELISA. Các trường hợp vật chủ mới khỏi bệnh, ký sinh trùng không còn tồn tại trong cơ thể nhưng kháng thể đặc hiệu vẫn tồn lưu trong máu dẫn tới hiện tượng dương tính giả của ELISA. Mặc dù vậy, phản ứng ELISA có ưu điểm nổi trội đó là có thể xét nghiệm cùng lúc nhiều mẫu bệnh phẩm, thời gian xét nghiệm nhanh, quy trình thực hiện đơn giản.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Quaquá trình nghiên cứu đề tài chúng tôi đã thu được những kết quả sau:
1 - Xác được các điều kiện nuôi cấy chủng E. coli BL21/pET – RoTAT theo phương pháp biến nạp dịch nuôi cấy được trải trên đĩa môi trường LB thạch có bổ sung chất kháng sinhAmpicillin 100 mg/ml và nuôi ở 37oC qua đêm.
2 - Biểu hiện được gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp đặc hiệu của kháng nguyên RoTAT 1.2, trong đó:
Xác định được thời gian tăng sinh của chủng biểu hiện tốt nhất là 4 giờ. Xác định được nhiệt độ tăng sinh của chủng biểu hiện ở 37o
C là phù hợp nhất. Xác định được mối tương quan giữa mật độ vi khuẩn và mức độ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 không ảnh hưởng nhiều tới mức độ biểu hiện.
Xác định được độ pH phù hợp để chủng E. coli BL21 – pET32(+) sinh tổng hợp protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 là khoảng 6 – 8.
Xác định được nồng độ kháng Amp là 100 g/ml là thích hợp để biểu hiện kháng nguyên từ chủng vi khuẩn này.
Xác định được ảnh hưởng của chất cảm ứng IPGT đến sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp ở nồng độ 3mM là thích hợp để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp.
3 - Biểu hiện và tinh sạch thành công kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 (kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của T. evansi đã được chế tạo thành công bằng công nghệ tái tổ hợp gen).
4 - Thiết lập thành công KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên trâu bò. Xác định được hàm lượng kháng nguyên RoTAT 1.2 là 30 g/ml và độ pha loãng kháng thể là 1: 400 thích hợp cho phản ứng ELISA.
Khảo sát tác nhân block giếng cho thấy sữa tách bơ 5% là hạn chế được hiện tượng dương tính giả trong phản ứng ELISA.
Xác định được thời gian thích hợp ủ kháng nguyên với kháng thể là 90 phút và thời gian ủ anti-bovine IgG:HRPO với phức hợp kháng nguyên kháng thể là 45 phút.
Xác định được độ nhạy của phản ứng (Se) là 94,12% và độ đặc hiệu (Sp) của phản ứng ELISA là 99,44%.
Xác định được mức độ lặp lại của kết quả phản ứng cho kết quả là tương đương nhau giữa các lần thí nghiệm.
5. Đánh giá được khả năng phát hiện của bệnh của phản ứng ELISA trên mẫu máu trâu, bò nghi nhiễm tiên mao trùng bằng cách so sánh với phản ứng PCR cho kết quả trùng hợp ngẫu nhiên của các mẫu dương tính là 75%, âm tính là 94%và tổng số là 91,7%.
2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1994), Công nghệ gen và công nghệ sinh học
ứng dụng trong nông nghiệp hiện đại. Nxb nông nghiệp, Hà Nội
2. Phạm Chiến, Nguyễn Đức Tân, Lê Đức Quyết (1999), “Kết quả khảo sát ký sinh trùng đường máu trên đàn bò ở huyện Mi Dinh Daklak", Kết quả hoạt động KHKT Thú y, tr. 53
3. Phan Văn Chinh (2006), Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi ở trâu,
bò nuôi tại các tỉnh miền Trung và biện pháp phòng trị, Luận án Tiến sĩ nông
nghiệp, Hà Nội.
4. Nguyễn Quốc Doanh (1999), Một số đặc tính sinh học của T. evansi (Steel, 1885), bệnh học do chúng gây ra, quy trình bảo quản và sử dụng giống T.
evansi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, Luận án Tiến sĩ nông nghiệp, Hà
Nội.
5. Lương Văn Huấn, Lê Hữu Khương (1997), Ký sinh và bệnh ký sinh ở gia súc,
gia cầm, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia – TP.HCM.
6. Nguyễn Đăng Khải (1995), "Về triệu chứng sảy thai trong bệnh tiên mao trùng trâu bò do T. evansi", Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập III,số 1, tr. 69 - 71.
7. Phạm Sỹ Lăng (1982), Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh tiên mao trùng trâu,
bò do Trypanosoma evansi ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ
khoa học Thú y.
8. Phan Địch Lân (1974), “Thành phần họ mòng Tabanidae và vai trò truyền bệnh của nó ở miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp.
9. Phan Địch Lân (2004), Bệnh ngã nước trâu bò, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 56 - 73.
10. Hà Viết Lượng (1998), Đơn bào ký sinh, đặc điểm dịch tễ và biện pháp phòng
trị bệnh Trypanosomiasis ở bò thuộc Nam Trung Bộ, Luận văn Thạc sĩ khoa
học Nông nghiệp, Hà Nội.
11. Lê Ngọc Mỹ (1994), "Kết quả bước đầu thiết lập phản ứng ELISA để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng". Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập II, số 1.
12. Lê Ngọc Mỹ (1994), "Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên và các phương pháp ký sinh trùng học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (T. evansi) ở trâu bò mắc bệnh tự nhiên", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số 4.
13. Đoàn Văn Phúc, Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Đăng Khải (1981), “Thí nghiệm dùng Trypamidium điều trị bệnh tiên mao trùng",Thông tin thú y - Viện Thú y, Hà Nội.
14. Đoàn Văn Phúc và cs (1994), “Kết quả ứng dụng một số phương pháp huyết thanh học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trâu ở thực địa", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số 1.
15. Vương Thị Lan Phương (2004), Nghiên cứu kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi phân lập từ trâu, bò phía Bắc Việt Nam và tinh chế kháng
nguyên dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp. Luận án Tiến sĩ
Nông nghiệp, Hà Nội.
16. Lê Đức Quyết (1995), "Tình hình trâu, bò nhiễm tiên mao trùng ở một số tỉnh duyên hải miền Trung và Tây Nguyên", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập III, số 3.
17. Khuất Hữu Thanh (2003). Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nxb khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
18. Khuất Hữu Thanh, (2006). Kỹ thuật gen – Nguyên lý và ứng dụng. Nxb khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
19. Nguyễn Như Thanh (2000), Cơ sở của phương pháp nghiên cứu dịch tễ học thú y, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tr. 126
20. Lương Tố Thu (1994), "Kết quả sản xuất Conjugate huỳnh quang chẩn đoán bệnh tiên mao trùng và so sánh độ nhạy của nó với các phương pháp chuẩn khác", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số 2.
21. Lương Tố Thu, Lê Ngọc Mỹ (1996), "Nghiên cứu ứng dụng các phương pháp ngưng kết trên bản nhựa (CATT) để chẩn đoán tình hình bệnh tiên mao trùng (do T. evansi) trên đàn trâu ở Việt Nam", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập IV, số 2.
*Tiếng Anh
22. Barry J. D., Tumer C. M. R. (1991), The diamics of antigenic variation and
23. Davison (1999). Evaluation of diagnostic test for T. evansi and then application in epidemiogical studies in Indonesia, PhS thesis Eliburgh.
24. Jacoboson RH (1998),The sensitivity and specificity of a test can be obtained,
Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Comell University, Ithaca, United States of America, pp. 469 – 486.
25. Holland WG, Claes F, My LN, Thanh NG, Tam PT, Verloo D, Büscher P, Goddeeris B, Vercruysse J (2001): A comparative evaluation of parasitological tests and a PCR for Trypanosoma evansi diagnosis in experimentally infected
water buffaloes.2001, 97 : 23-33. PubMed Abstract
26. Hoare C. A. (1972), The Trypanosomes of MammaIs. A zoological monograph, Black well scientific Publication. Oxford and Edinburgh.
27. Losos G. J., Ikede B. O. (1972),” Review of the pathology of diseases of domectic and laboratory animal” caused by T. congolense, T. vivax, T. brucei, T. rhodensiense and T.
gambiense, Joumal of Veterinary pathology, 9, pp. 1 - 15
28. Luckins A. G (1988), Trypanosoma evansi in Asia, Parasitology today, pp. 3 - 49. 29. Raper J., Portela Molina M. P., (2002), Natural immunity to human African
trypanosomiasis: Trypanosomelytic factor and the blood incubation infectivity test. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg, Apr, 96.
30. Urakawa T, Phelix AO Majiwa , Bruno Goddeeris, Philip, Magda Radwanska (2001), Variable Surface Glycoprotein RoTat 1.2 PCR as a specific diagnostic
tool for the detection of Trypanosoma evansi infections, Japan
International.Cooperation Agency.
31. Ventura, Verloo D, Moens L, Büscher P, Majiwa PAO(2004): Trypanosoma evansi: cloning and expression in Spodoptera fugiperda insect cells of the diagnostic antigen RoTat 1.2.
32. Yoshihito Kiwaraki, (2002), Immunological Laboratory techniques, Japan International.Cooperation Agency.
33. Bashir Salim, (2010), DNA Extratcion from FTA – cards
www.animalgenone.org.com.muity/.../3429.html