Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất
Tủ ấm ổn nhiệt Sanyo (Nhật)
Máy PCR(Gen Amp PCR system 9700) Applied BioSiences (Mỹ)
Máy PCR (Thermo cycle) Bio – Rad (Pháp)
Máy ly tâm lạnh (Biofuge Primo R) Heraeus (Mỹ)
Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Thommas Scientific(Mỹ)
Máy chụp ảnh Gel – Doc Dolphin (Mỹ)
Tủ lạnh – 20oC, - 80oC Nuaire (Mỹ)
Lò vi sóng Sanyo (Nhật)
Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire Nuaire (Mỹ)
Bể ổn nhiệt Memmert (Đức)
Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument (Đức)
Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop Analitika (Đức)
Máy phân tích trình tự ADN ABI 3100 –Avant Applied Bíociences (Mỹ)
Cân điện tử Adam
Bộ điện di ADN Labnet
Bộ điện di Protein Labnet
Máy hút chân không Speed – Vac 110A Savant (Mỹ)
Máy Vortex Mimishaker, IKA (Đức)
2.1.4. Môi trường và đệm
Môi trường nuôi vi khuẩn và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được chuẩn bị theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.1.5. Cặp mồi sử dụng
Để khuếch đại trình tự gen RoTAT 1.2 có kích thước 215 bp của
Trypanosoma evansi, Bashirsalim và cs (2010) đã dùng 1 cặp mồi gồm:
Mồi xuôi (5’- GCG GGG TGT TTA AAG CAA TA- 3’) và mồi ngược (3’- ATT AGT GCT GCG TGT GTT CG -5’)
2.2. Nội dung, địa điểm và thời gian nghiên cứu + Nội dung nghiên cứu: + Nội dung nghiên cứu:
-Nghiên cứu xác định các điều kiện nuôi cấy chủng E. coli BL 21/pET – RoTAT 1.2 để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2.
-Nghiên cứu ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để thiết lập phản ứng ELISA chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
-Bước đầu đánh giá hiệu quả chẩn đoán bệnh tiên mao trùng của phản ứng ELISA với kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.
+ Địa điểm nghiên cứu:
Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 5 năm 2012 đến tháng 6 năm 2013
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu
Chủng vi khuẩn tái tổ hợp gen ROTAT 1.2
Tách tinh sạch protein tái tổ hợp
Đánh giá tính kháng nguyên của Protein tái tổ hợp gen RoTAT 1.2
Xây dựng quy trình thực hiện phản ứng ELISA phát hiện bệnh
TMT
Lên men: (xác định các điều kiện lên men chủng tái tổ hợp: IPGT,
2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Phương pháp tách ADN
Phương pháp tách ADN được thực hiện theo các bước sau:
- Tăng sinh vi khuẩn E. coli BL21 – RoTAT 1.2 trong thạch LB lỏng ở 37oC trong thời gian 18 giờ.
- Ly tâm tốc độ 6000vòng/15phút
- Hoà cặn bằng nước cất sạch không chứa ADN (200 μl) - Xử lý nhiệt ở nhiệt độ 95oC/7phút
- Ly tâm 10.000 vòng/20 phút thu dịch nổi
- Điện di ADN trên Agrose gel 1.2% để kiểm tra sản phẩm tách.
2.3.2.2. Phương pháp xử lý enzym cắt giới hạn
Nguyên lý:
Enzym cắt giới hạn là các nuclease nội bào (endonuclease) có khả năng nhận biết và cắt đoạn ADN tại các vị trí với trình tự nucleotide nhất định. Trong nghiên cứu này, hai enzym cắt giới hạn EcoRI và HindIII được sử dụng với các mục đích bao gồm:
i) để tạo đầu cắt so le cho gen RoTAT 1.2 sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng pET 32 a (+).
ii) để mở vòng vector biểu hiện pET 32 a (+) để sử dụng cho phản ứng kết nối với gen RoTAT 1.2.
iii) để kiểm tra vetor tái tổ hợp tách chiết từ dòng tế bào vi khuẩn E.coli
chủng BL21(DE3) sau khi được chuyển sang vector này. Về nguyên tắc thành phần cắt enzym giới hạn không khác nhau, điểm khác nhau chỉ có là thể tích của các thành phần sẽ được điều chỉnh cho thích hợp với mỗi mục đích và ADN mẫu.
Tiến hành:
Phản ứng cắt mở vòng vector pET 32 a (+) được thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích(μl)
Nước khử ion vô trùng 4 Đệm EcoRi (10X) 1,5 EnZym EcoRI (10u/μl) 1 EnZym HindIII(10u/μl) 1 Plasid pET 32 a (+) 7,5
Tổng thể tích 15 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phản ứng tạo đầu cắt so le cho gen RoTAT 1.2 sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng pET 32a (+) được thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích(μl)
Nước khử ion vô trùng 12 Đệm EcoRi (10X) 5 EnZym EcoRI (10u/μl) 1,5 EnZym HindIII(10u/μl) 1,5 Sản phẩm PCR 20
Tổng thể tích 30
- Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET 32 a (+) mang gen RoTAT 1.2 tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích(μl)
Nước khử ion vô trùng 1 Đệm EcoRi (10X) 1 EnZym EcoRI (10u/μl) 1 EnZym HindIII(10u/μl) 1 Plasid pET 32 a (+) 5
Tổng thể tích 10
Thành phần phản ứng được trộn đều và chạy PCR trong 2 giờ ở nhiệt độ 37oC, các sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.3.2.3. Phương pháp tinh sạch AND từ gel agarose
Nguyên lý:
Phương pháp này được áp dụng để tinh sạch đoạn ADN quan tâm từ bảng điện di trên gel agarose.Trong trường hợp này, đoạn gen RoTAT 1.2 sau khi được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector pET 32 a (+) sẽ được tinh sạch để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu. Trong phương pháp này, phân tử ADN quan tâm sẽ giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất là các hạt sepharose, sau đó sử dụng đệm để thu lại các phân tử ADN này. Thông qua phương pháp lấy mẫu, ADN sẽ đủ tinh sạch để tiến hành các phản ứng khác như xử lý enzym hạn chế hay kết nối với vector.
Tiến hành:
-Cắt vùng gel chứa đoạn ADN quan tâm trên bản điện di.
-Cân đoạn gel vừa cắt được để xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1 mg trọng lượng sẽ tương ứng với 1 µl thể tích.
-Thêm V ml Gel Binding Buffer vào ống eppendorf [với tỉ lệ VBuffer = 3 Vgel]. -Ủ hỗn hợp ở 60o
C trong 10 phút và cứ 2 phút votex 1 lần để hòa tan gel hoàn toàn.
-Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết ADN và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
-Tiếp tục bổ sung đệm rửa 500μl WB (Washing Buffer), ly tâm 13000 vòng trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
-Ly tâm tiếp 13000 vòng trong 1 phút để cột khô hoàn toàn.
-Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5 ml. Bổ sung 30 μl nước khử trùng, để ở nhệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13000 vòng/phút trong vòng 1 phút để thu mẫu DNA.
2.3.2.4. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector
Nguyên lý:
T4 ligase xúc tác tạo liên kết photphatdieste bằng cách liên kết đầu 5’ photphat trog phân tử ADN hoặc ARN này với đầu 3’ hydroxyl của phân tử ADN hoặc ARN kia, do vậy có thể nối 2 sợi ADN hoặc ARN khác nhau. Vector biểu hiện
tái tổ hợp được thiết kế bằng cách ghép đoạn gen RoTAT 1.2 và plasmid pET 32 a(+) sau khi đã xử lý bởi hai enzym giới hạn là EcoRI và HindIII.
Tiến hành:
-Tính nồng độ vector và nồng độ mẫu ADN trong trường hợp nối đầu so le (tỉ lệ về số mol giữa vector: đoạn gen RoTAT 1.2 chèn là 1 : 4)
-Tính các thành phần còn lại cho 1 phản ứng và mix phản ứng.
Phản ứng kết nối đoạn ADN vừa tinh sạch vào vetor tách dòng được thực hiện trong hỗn hợp sau:
Thành phần phản ứng Thể tích(μl) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nước khử ion 2 Đệm T4 ligase (10X) 2 Gen RoTAT 1.2 (100ng) 12 Plasmid pET 32a (+) (20ng) 2 Enzym T4 ligase (1u/1μl) 2
Tổng thể tích 20
Phản ứng kết nối được thực hiện trong 2 giờ ở nhệt độ 22oC. Sau khi kết thúc, hỗn hợp dùng để biến nạp hoặc lưu giữ ở tủ lạnh - 20oC.
2.3.2.5. Phương pháp tiến hành biến nạp AND plasmid vào tế bào vi khuẩn
Nguyên lý:
Biến nạp là quá trình chuyển ADN trực tiếp vào tế bào nhận. Những tế bào có khả năng tiếp nhận ADN được gọi là tế bào khả biến.
Tiến hành:
- Bổ sung 1 µl ADN plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100 µl). - Để ổn định trong nước đá trong vòng 15 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong nước đá 15 phút.
- Bổ sung 400 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong vòng 1 giờ, ở 37oC.
- Cấy trải (100 µl - 150 µl) trên môi trường thạch LB chứa ampicilin (100 mg/l).
2.3.3. Phƣơng pháp biểu hiện
Cảm ứng mẫu
Nguyên tắc:
Nuôi cấy các thể biến nạp trong môi trường có chất cảm ứng promoter để protein tái tổ hợp có thể được tổng hợp. Sau đó, kiểm tra protein tái tổ hợp bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide để phát hiện băng protein tái tổ hợp.
Cách tiến hành:
Lấy 1 khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp cho vào môi trường LB lỏng chứa kháng sinh thích hợp, nuôi lắc 200 v/ph, 37oC, qua đêm.
Cấy chuyển sang môi trường LB lỏng chứa kháng sinh thích hợp với tỷ lệ chủng là 2%.
Nuôi lắc 200 v/ph, 37oC đến khi đạt OD600 thích hợp.
Thu mẫu trước cảm ứng, sau đó bổ sung vào dịch nuôi chất cảm ứng IPTG với nồng độ thích hợp.
Nuôi với chế độ và thời gian thích hợp cho sự biểu hiện. Thu mẫu sau cảm ứng.
2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+
Cột sắc ký ái lực Ni2+được thiết kế để tinh sạch protein tái tổ hợp có chứa 6 gốc histidine. Đây là đuôi Histag được mã hóa bởi các bộ 3 mã hóa nằm trên vector do nhà sản xuất thiết kế có ái lực mạnh đối với Ni2+.Có thể dùng cột sắc ký ái lực Nikel resin để tinh sạch những protein tái tổ hợp được biểu hiện trong nhiều loại vật chủ khác nhau.
Qui trình:
Ly tâm thu cặn tế bào từ 50 ml môi trường.
Bổ sung 8 ml Guanidin Lysis Buffer (6 M Guanidin hydrochloride, Sodium phosphate 20 nM, pH 7.8, NaCl 500 mM), vortex nhẹ.
Dùng siêu âm để phá tế bào trong 5 phút.
Ly tâm 5.000 v/p, thu dịch nổi để chuyển lên cột Ni. Đảo đều trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Cố định cột theo chiều thẳng đứng cho dịch chảy ra từ từ.
Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Binding Buffer (8 M Urea; 20 mM Sodium phosphate pH = 7,8; NaCl 500 mM).
Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Wash Buffer (8 M Urea; Sodium phosphate 20 mM pH = 6; NaCl 500 mM). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rửa cột 4 lần bằng 8 ml Native Wash Buffer (Native Purification Buffer và Imidazole pH = 6).
Thu protein RoTAT 1.2 bằng 6 ml Native Elution Buffer, thu 5 phân đoạn mỗi phân đoạn 1 ml.
2.3.2.7. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
Nguyên lý chung:
Điện di là kĩ thuật được dùng để phân tách các protein dựa trên cơ sở kích thước, khối lượng, diện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.
Tiến hành:
Điện di protein được tiến hành trên gel polyacrylamide, chuẩn bị với những thành phần như sau:
Bảng 2.3. Công thức pha gel tách (12%)
Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 12% 10 ml dH2O vô trùng 2,6 30% Acrylamid 12% 3,2 Tris – HCl 1,5 M; pH 8,8 0,375 M 2,04 10% SDS 0,1% 0,08 10% APS 0,1% 0,08 TEMED 0,002% 0,0032
Bảng 2.4. Công thức pha gel co (5%)
Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 12% 10 ml dH2O vô trùng 1,4 30% Acrylamid 5% 0,33 Tris – HCl 1,5 M; pH 8,8 0,13 M 0,25 10% SDS 0,1% 0,02 10% APS 0,1% 0,02 TEMED 0,001% 0,002
2.3.2.8. Phương pháp tinh sạch protein
Nguyên lý:
Protein tái tổ hợp thu được dưới dạng dung hợp có đuôi His – tag nên dễ dàng tinh sạch thông qua phương pháp sắc khí ái lực sử dụng cột Nikel.
Tiến hành:
Tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp được nuôi trong 100 ml môi trường thạch LB lỏng có bổ sung ampicillin và cảm ứng IPTG với nồng độ cuối cùng là 0,1 mM, trong khoảng thời gian 5 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC.
-Ly tâm 400 ml dịch khuẩn 8000 vòng/phút trong 15 phút rồi tiến hành thu cặn. -Thêm 15 ml dung dịch đệm gắn (Binding buffer).
-Ủ trong đá 5 phút.
-Tiến hành ly- tâm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 30 giây/lần, nghỉ 30 giây trong 20 phút.
-Chia nhỏ dung dịch ra các ống Eppendorf 2 ml, tiến hành ly tâm 3000 v/p trong 10 phút, rồi thu dịch.
-Phần dịch nổi chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột Nickel – Chelating Resin đã chuẩn bị truớc.
-Đảo nhẹ để giữ resin lơ lửng trong dịch nổi có chứa protein khoảng 1 giờ. -Lắng resin bằng trọng lực rồi thu dịch, cất ở tủ 4oC để điện di kiểm tra. - Rửa cột với 8 ml Native Wash Buffer với thành phần: 50 ml dung dịch đệm tinh sạch (Native rification buffer) (250 mM NaH2PO4, pH = 8,0, 2,5 mM NaCl), 335 μl dung dịch imidazole 3 mM, pH 6,0 đảo nhẹ cho resin lơ lửng, rồi lắng resin, thu dịch cất ở tủ 4oC để điện di kiểm tra.
- Lặp lại bước trên 3 lần.
-Bổ sung 9 ml đệm thôi (Native Elution Buffer) để protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột bằng đệm thôi có thành phần 50 mM NaH2PO4 pH 8,0; 500 mM NaCl, 250 mM imidazole và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%.
2.3.5 Phương pháp điện di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [32]
Nguyên tắc:
Điện di là qua trình dịch chuyển của các phân tử protein tích điện trong một dung dịch đặt trong điện trường. Các phân tử protein mang điện tích âm sẽ dịch chuyển về phía cực dương của điện trường. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử mang điện phụ thuộc hình dạng và kích thước của phân tử protein, phân tử có kích thước và khối lượng phân tử lớn sẽ chạy chậm hơn những phân tử nhỏ.
Kĩ thuật SDS – PAGE được dùng trong nghiên cứu enzyme, để xác định phân tử lượng protein, hàm lượng, độ tinh sạch của protein.
Tiến hành:
- Bước 1. Chuẩn bị gel SDS-PAGE: thành phẩn bản gel trong phụ lục bảng 13. Bản gel gồm có gel phân cắt và gel phân tách protein được đổ khuôn và tạo các giếng chứa protein (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bước 3. Nhỏ mẫu: kháng nguyên được pha loãng ở các nồng độ nồng độ khác nhau và nhuộm bằng thuốc nhuộm có chứa commasie blue và - mercapthoethanol rồi biến tính protein ở 950C/5 phút. Nhỏ 15-20 µl mẫu vào mỗi giếng, và 10µl marker chuẩn trên một giếng.
- Bước 4. Điện di: quá trình điện di thực hiện ở hiệu điện thế 120 V đến khi màu thuốc nhuộm chạy đến chân bản gel tách.
- Bước 5. Nhuộm gel: bản gel được nhuộm bằng dung dịch Coomassie blue R–250 0,1% ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và có lắc.
- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy trên máy lắc, thay dung dịch tẩy khoảng 2 – 3 lần đến khi thấy các vạch điện di xuất hiện.
2.3.6 Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [32]
- Nguyên liệu
+ Đĩa ELISA: đĩa bằng chất liệu nhựa polypropylene có 96 giếng, có khả năng hấp thụ kháng nguyên tốt.
+ Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ, conjugate (chất gắn kết) có gắn enzmyme peroxydase, bubtrate (chất tạo màu phản ứng, thường là TMBZ (3,3’,5,5’ Tetramethybenzodine)), PBS, PBS-Tween, Sữa tách bơ (casein).
+ Máy đọc phản ứng + Các dụng cụ thí nghiệm - Trình tự phản ứng:
Bước 1. Phủ kháng nguyên 100 µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ thích hợp được gắn trực tiếp vào đĩa ELISA. Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37oC trong 2 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 2. Phủ đĩa bằng 200 µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 3. Gắn kháng thể: 100 µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng dung dịch PBS – sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37o C, lắc sau 30