3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2
Lựa chọn 3 khuẩn lạc phát triển tốt, đánh số 1, 2 và 3 và nuôi cấy hoạt hóa trong môi trường LB lỏng qua đêm ở 37o
C, nuôi lắc 200 vòng/phút.
Theo hướng dẫn của hãng Invitrogen (hãng cung cấp vector pET), điều kiện biểu hiện ban đầu được đưa ra là nuôi hoạt hóa 1% đến khi OD đạt khoảng 0,6 – 0,8 thì cảm ứng bằng IPTG ở nồng độ 0,6 - 1 mM, nuôi lắc 37oC, sau 3 – 4 h protein sẽ được biểu hiện. Mẫu được đem chạy điện di trên gel polyacrylamid để kiểm tra kết quả. Dưới đây là hình ảnh điện di để kiểm tra kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 trong E. coli (hình 3.3).
Hình 3.3. Kết quả điện di protein tổng số của trên gel SDS-PAGE
(M: thang chuẩn; giếng 1-2: E. coli BL21- pET32/RoTAT 1.2 cảm ứng với IPTG; giếng 3-4: E. coli BL21pET32/RoTAT 1.2 không cảm ứng với IPTG; giếng 5: E. coli BL21- pET32/RoTAT 1.2)
Chất cảm ứng IPTG (isopropyl -D- thiogalactoside) rất cần thiết cho việc khởi đầu tổng hợp protein. IPTG làm cho operon Lac chuyển từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt động và protein được tổng hợp. Theo như tính toán lý thuyết kháng nguyên RoTAT1.2 có kích thước khoảng 8 kDa. Trên hình 3.2 cho thấy ở các mẫu có cảm ứng với IPTG (đường chạy số 1-2) xuất hiện một băng protein mới có kích thước nằm ở khoảng giữa 8 kDa còn ở mẫu không cảm ứng với IPTG (đường
chạy số 3-4) không thấy xuất hiện băng này. Hơn nữa, ở mẫu nuôi E. coli BL21- pET32/RoTAT 1.2 cũng không bổ sung IPTG (đường chạy số 5) không thấy xuất hiện băng protein trên. Như vậy, băng protein xuất hiện mới này khả năng lớn chính là protein tái tổ hợp đích mà chúng tôi cần biểu hiện. Mặc dù mức độ biểu hiện của gen tái tổ hợp còn thấp, nhưng chúng tôi có thể kết luận sơ bộ rằng đã biểu hiện thành công kháng nguyên RoTAT 1.2 trong E. coli. Để có thể thu được lượng kháng nguyên tái tổ hợp lớn hơn, chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện biểu hiện của gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3).
Một đặc tính bắt buộc của kháng nguyên đó là phải được nhận biết bởi kháng thể đặc hiệu. Vi khuẩn E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 biểu hiện thành công protein tái tổ hợp nhưng protein này có thể hiện tính đặc hiệu của Trypanosoma
evansi hay không, chúng tôi tiến hành thực hiện kiểm tra bằng Western blot. Kết
quả thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi
(M: thang chuẩn; protein RoTAT 1.2 được phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu của
Trypanosoma evansi)
Hình 3.4 cho thấy trên bản nitrocellulose xuất hiện 1 vạch phản ứng, xấp xỉ với kích thước 8 kDa, bằng đúng với kích thước của protein RoTAT 1.2. Từ kết quả này chúng tôi khẳng định rằng đã biểu hiện thành công kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli.
3.3. Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong E. coli