Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2.VECTOR TÁCH DÒNG
1.2.1. Khái niệm
Vector tách dòng còn gọi là phương tiện vận chuyển gen. Vector tách dòng thường là các phân tử ADN có kích thước nhỏ, cho phép cài (gắn) các gen cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào. Vector tách dòng phải có khả năng tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ, ít gây biến đổi bộ gen của tế bào vật chủ. Các vector tách dòng phải mang các gen ”tín hiệu” để dễ dàng nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp.
Mục đích của việc tách dòng là để thu nhận được gen hay một trình tự ADN tinh sạch với hàm lượng lớn.
Vector tách dòng có 3 đặc tính cơ bản: Có khả năng xâm nhập vào tế bào.
Có điểm mở đầu để tái bản, tức là có khả năng tái bản tích cực, không phụ thuộc vào sự sao chép của bộ gen tế bào chủ.
Các thể biến nạp phải dễ dàng được chọn lọc và sinh trưởng tốt trên môi trường đặc. Khả năng chọn lọc được mã hóa bởi các gen chọn lọc, thường là đặc tính kháng với chất kháng sinh.
Ngoài ra, vector tách dòng sẽ được xem là càng mạnh khi có thêm các ưu điểm sau đây:
Có kích thước nhỏ để có thể thu nhận được tối đa lượng ADN, dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sao chép nhanh.
Tồn tại được qua nhiều thế hệ trong tế bào vi khuẩn và ít gây xáo trộn đối với quá trình trao đổi chất của tế bào chủ.
Mang các vị trí nhận biết duy nhất của nhiều loại enzyme giới hạn và vị trí đó nằm trong các gen chọn lọc.
Trong số các loại vector hiện có thì plasmid được sử dụng phổ biến nhất do dễ dàng nhân lên trong tế bào vi khuẩn và có kích thước nhỏ (1kb - 200kb). Các thế hệ plasmid ngày càng được cải tiến và mang các đặc tính mới, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách dòng.
1.2.2. Các loại vector tách dòng
Vector tách dòng gồm nhiều loại như: plasmid, phage, cosmid, phagemid, virus, nhiễm sắc thể nhân tạo của tế bào nấm men...Mỗi loại vector tách dòng có những ưu, nhược điểm nhất định. Tùy thuộc kích thước của gen cần tách dòng và đặc điểm của loại tế bào chủ để chọn loại vector tách dòng thích hợp.
Vector tách dòng là plasmid: plasmid là những phân tử ADN có kích thước nhỏ (2kb - 5kb) dạng vòng, nằm trong nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, nấm men...Một số loại vector tách dòng thường được sử dụng như: pBR322, pSC101, ColE1...
Vector tách dòng là phage: các phage sử dụng làm vector tách dòng hiện nay phần lớn đều bắt nguồn từ phage cos ADN. Phage cos ADN là phage mạch kép kích thước 48.502 bp. Sử dụng phage làm vector tách dòng hiệu quả với tế bào chủ
prokaryote và eukaryote (các plasmid sử dụng với tế bào eukaryote thường không có
kết quả). Ví dụ: Các loại phage M13, phage EMBL4, phage GEM...
Vector tách dòng là cosmid: cosmid là vector nhân tạo, ghép nối từ một plasmid với đoạn trình tự cos của phage. Trình tự cos điều khiển sự đóng gói ADN của phage vào phần đầu của phage. Vector tách dòng là cosmid cho phép cài gắn đoạn ADN có kích thước 40 - 50 kb.
Vector tách dòng là phagemid: phagemid là các cloning vector được cấu tạo trên cơ sở của vector tách dòng Plasmid pBR322 được gắn thêm đoạn khởi đầu tái bản (Ori) của phage fl, một đoạn có chứa promoter của phage T3, T7 và polycloning site. Điển hình cho phagemid là nhóm plasmid bluescript, là loại plasmid mạnh được sử dụng nhiều trong công nghệ ADN tái tổ hợp.
1.2.3. Plasmid PCR 2.1
Plasmid PCR 2.1 là vector tách dòng đang được sử dụng phổ biến, có hiệu quả cao, với ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có một bazơ Timin.
Vector PCR 2.1 có kích thước 3,9 kb, mang điểm khởi đầu tái bản của plasmid pUC nên có khả năng nhân lên với số lượng rất lớn trong tế bào vi khuẩn
E.coli. Vector được thiết kế có gắn một operon chuyển hóa đường lactoza là
operon- lac. Sau vị trí promoter là đoạn LacZα mã hóa cho 146 axitamin đầu tiên của enzyme β- galactosidase, là vùng cắt gắn đa vị được thiết kế trên đoạn này với 17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn: EcoR I, hind III, Nsi I, Kpn I, Sac I, BamH I,
Spe I, BstX I, EcoR V, Not I, Ava I, PaeR7 I, Xho I, Xba I, Apa I. Trong đó, EcoR I và BstX I có 2 vị trí cắt, các enzyme còn lại chỉ có 1 vị trí cắt. Với vị trí của vùng cắt đa điểm như vậy, sản phẩm β- galactosidase có thể được tạo ra (nếu vector không được dính đoạn ADN ngoại lai, khuẩn lạc màu xanh) hoặc không được tạo ra (nếu vector được dính đoạn ADN ngoại lai và khuẩn lạc có màu trắng trên môi trường thạch). Dựa vào dấu chuẩn đó, người ta có thể lựa chọn được những tế bào mang vector tái tổ hợp với tần suất cao.
Một ưu điểm nữa của PCR 2.1 là nó mang promoter của thực khuẩn thể T và các vị trí gắn mồi xuôi và ngược của thực khuẩn thể M13, nhờ đó có thể phiên mã được đoạn ARN antisense và đọc trình tự đoạn ADN.
Ngoài ra, vector PCR 2.1 có chứa gen kháng sinh là Amp và Ka, nhờ đó mà có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa Amp hoặc Ka với nồng độ ức chế tối thiểu.
1.2.4. Vector tách dòng pJET1.2/blunt
Vector tách dòng pJET1.2/blunt được tách chiết từ dòng tế bào E. coli
DH5α/pJET1.2/blunt và được cắt mở vòng bằng enzyme Klenow.
Hình 1.2 Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2-RoTAT 1.2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo thiết kế, vector pJET1.2/blunt có chứa gen mã hóa kháng kháng sinh ampicillin cho phép dễ dàng phát hiện vector tái tổ hợp một cách đơn giản bằng sự phát triển của các khuẩn lạc trên môi trường có chứa kháng sinh ampicilin với nồng độ 100μg/ml.